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Anal. Chem. | 中科院叶明亮博士基于PRM技术靶向蛋白质组学分析蛋白质复合物中蛋白质磷酸化修饰

前言

PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术,完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等技术。其优势在于克服了抗体制备难,买不到抗体的困境。同时对于组学的结果验证率有很大改善。本篇由叶明亮博士中国科学院特聘研究员团队发表在《Analytical Chemistry》上的A pseudo-targeted MS method for the sensitive analysls of protein phosphorylation in protein complexes.通过PRM技术对纯化的EGF信号四个时间阶段的内源性Shc1蛋白复合物进行磷酸肽的鉴定及定量,共鉴定到82个磷酸位点,是该蛋白质复合物中鉴定出的最多磷酸化位点数。

 

基本信息

英文标题:A pseudo-targeted MS method for the sensitive analysls of protein phosphorylation in protein complexes

中文标题:基于靶向蛋白质组学分析蛋白质复合物中蛋白质磷酸化修饰

材料:纯化的蛋白质复合体           

影响因子:6.35

发表期刊:Anal. Chem. 

主要运用技术:PRM技术

 

研究背景

本研究通过并行反应监测(PRM)技术建立了一种无需富集并可灵敏分析微量样品(如纯化的蛋白质复合物)中蛋白质磷酸化的流程,该流程以数据依赖性获取(DDA)数据集中鉴定的磷酸肽(包括低可信度磷酸肽)构建PRM分析列表。本文通过该方法对纯化的EGF信号四个时间阶段的内源性Shc1蛋白复合物进行磷酸肽的鉴定及定量,共鉴定到82个磷酸位点,是该蛋白质复合物中鉴定出的最多磷酸化位点数。

 

流程方法

1.基于PRM技术分析蛋白质复合体磷酸化的流程

通过DDA鉴定磷酸化肽段,再DDA打分值低的磷酸化肽段建库,PRM进一步验证。

 

 

2.PRM谱图质量优于DDA

 

 

3.多次DDA或PRM实验无法显著提高覆盖率

 

 

4基于PRM定量分析EGF刺激后Shc-1复合物的动态变化

 

 

小鹿推荐

本文为应用PRM技术鉴定并定量蛋白质翻译后修饰的例子。传统技术对于翻译后修饰的验证较为困难,而PRM技术无需抗体,可靶向对翻译后修饰的肽段进行检测及定量,且灵敏度及定量准确性均优于DDA模式。本文对纯化的蛋白质复合体中磷酸化修饰进行检测,无需进行磷酸化富集即可检测出Shc1蛋白复合物中的82个磷酸化位点。若样本为复杂样品,则先进行磷酸化富集,再PRM检测效果会更好。

 

参考文献

Lyu J.et al., PseudotargetedMS Method for the Sensitive Analysis of Protein Phosphorylation in Protein Complexes.2018,Anal Chem.

 

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PRM简介

PRM:平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行相对或绝对定量。PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术,完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等。PRM技术运用平行反应监测技术特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子并进行定量,可以有效排除干扰离子,提高蛋白质的定量准确性。

PRM靶向定量蛋白质组学分析基本流程

 

PRM优势

 

PRM技术较传统的Western blot、ELISA等靶向蛋白验证技术具有如下优势:

1. 克服了抗体制备难,买不到抗体的困境。  

2.PRM技术与DIA/iTRAQ/TMT技术都是基于质谱技术,对于组学的结果验证率有很大改善。 

3. 一次针对30个左右的目的蛋白进行精确靶向定量。

 

 PRM技术优势 

DIA+PRM适用领域

 

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