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Nature Methods 关注技术|新一代蛋白组技术+WB替代技术重磅来袭

随着质谱仪器的不断更新换代,蛋白组学的技术也不断的革新,从最早的2-D电泳技术到基于LC-MS/MS的蛋白定性;从Label free 技术到标记定量iTRAQ/TMT技术以及时下备受推崇的DIA/SWATH技术、PRM/MRM技术,每一次的技术革新都使得蛋白组学研究更上一阶。蛋白DIA定量分析技术也被《Nature Methods》杂志评为最值得关注的技术之一

 

DIA+PRM技术    

当下蛋白组学研究中应用最广泛的技术是同位素标记定量(iTRAQ/TMT技术)。iTRAQ/TMT技术是利用DDA扫描模式,其扫描的方式是将一级质谱信号最强的Top 20的多肽进行二级打碎,然后进入二级质谱进行检测。其优势是二级谱图采集的肽段信息都来源于同一条多肽,有利于后续的定性分析,但这种采集方式会忽略一些肽段的信息;而且对于大样本量的组学实验,iTRAQ/TMT技术也存在一定的通量限制。那么有没有一种技术可以解决目前蛋白组学困局呢?

 

对于组学数据的验证,常规的方法有:PCR、RT-PCR、WB技术、ELISA技术等,但是对于蛋白组学的验证,RNA水平的验证显然不能满足科研工作者的要求;WB技术和ELISA技术虽然在某种程度上解决了不同组学之间的尴尬,但是由于抗体的定制难度,在非模式物种中的应用一直无法进行。在这样的一个基础上,DIA、PRM技术隆重登场...DIA+PRM技术可以解决目前蛋白组学中存在的这些问题。

 

DIA技术原理

DIA技术是先利用常规DDA质谱检测技术分析建立图谱库,之后采用DIA方法进行质谱数据采集,从而实现对样品中蛋白质的定性及定量,不同于传统的DDA技术,DIA技术将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂、检测,因此可以无遗漏地获得样本中所有离子的全部碎片信息,数据利用度大大提高,缺失值更少。因此,DIA技术更适合于大样本量、复杂体系的蛋白检测。

 

DIA技术流程

 

 

DIA优势

DIA技术是基于质谱的新一代蛋白组学技术,DIA技术采用数据非依赖性采集扫描模式,摆脱了传统DDA(代表性技术:iTRAQ/TMT)扫描的偏好性制约,可以无遗漏地获得样本中所有离子的碎片信息,以达到样本数据的完整性。

 

DIA技术较传统的iTRAQ/TMT/Labelfree蛋白组技术而言,具有如下优势

1. 保证了数据的完整性,缺失值少。 

2. 克服了iTRAQ/TMT的通量低的限制。 

3. 提高了低丰度蛋白的检出率。 

4. 鹿明生物基于Thermo公司的QE-HF高端质谱,检出率提升20%以上。

 

 

PRM技术原理

PRM:平行反应监测(Parallel Reaction Monitoring) 是一种基于高分辨、高精度质谱的离子监视技术,能够对目标蛋白质、目标肽段(如发生翻译后修饰的肽段)进行选择性检测,从而实现对目标蛋白质/肽段进行相对或绝对定量。PRM技术是基于质谱的靶向验证蛋白组学技术,完美的替代了基于抗体的Western blot、ELISA等PRM技术运用平行反应监测技术特异性地选择与预先设定质荷比相同的肽段离子并进行定量,可以有效排除干扰离子,提高蛋白质的定量准确性。

PRM靶向定量蛋白质组学分析基本流程

 

 

PRM优势

PRM技术较传统的Western blot、ELISA等靶向蛋白验证技术具有如下优势:

1. 克服了抗体制备难,买不到抗体的困境。  

2.PRM技术与DIA/iTRAQ/TMT技术都是基于质谱技术,对于组学的结果验证率有很大改善。 

3. 一次针对30个左右的目的蛋白进行精确靶向定量。

 

 PRM技术优势 

 

PRM和DIA各自都有这么多优势,那将这2个前沿的技术合起来使用会是什么样的效果呢?显而易见,合起来使用,你不仅可以享受到给各自的优势,还具备PRM验证可使用DIA的数据库资源,也就是说不用重复建库,一个数据库就搞定(PS:省了一笔重复建库费用);另外,PRM验证让您不再忧愁各种途径找定制化抗体。

那么DIA+PRM技术能够适用哪些研究呢?答案是各领域均适用,尤其适合临床医学样本,强力推荐。

 

DIA+PRM适用领域

 

DIA+PRM技术讲座

时间:7月26日

地点:线上讲座

主讲人:徐燕

主讲人简介:上海交通大学系统生物医学研究院毕业,研究方向疾病蛋白质组学,学位论文为脓毒症血浆外泌体的分离提纯及其蛋白质组研究,并以第一作者在Biochemical and biophysical research communications上发表SCI论文。

讲座简介:1、蛋白组学技术概括 2、DIA技术+PRM技术简介 3、技术研究思路及文献挖掘   4、DIA、PRM技术研究流程    5、投稿推荐等干货内容

 

 

欢迎添加微信申请免费讲座和课件

 

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DIA+PRM技术实例分析

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前言

 

Early B cell factor 1(EBF1)是协调B细胞谱系发育所需的关键转录因子之一。尽管研究表明Ebf1单倍剂量不足(haploinsufficiency)参与白血病的发展,但尚未表征Ebf1杂合性对pro-B淋巴细胞蛋白质组的全局影响。来自德国弗莱堡马克斯普朗克免疫生物学和表观遗传学研究所Gerhard Mittler团队,通过DDA(data dependent acquisition)和DIA(data independent acquisition)质谱技术鉴定Ebf1+/+ and Ebf1+/-细胞系间的差异表达蛋白,发现DIA鉴定结果无论是蛋白鉴定数目还是得到的差异蛋白数目,均要优于DDA鉴定结果。

 

 

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基本信息

中文标题:蛋白质组学DIA+PRM技术研究Pro-B淋巴细胞Ebf1杂合性

发表日期:2018.1.5

发表期刊:J Proteome Res.

主要运用技术:DIA+PRM

 

 

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结果分析

 

图1 | 比较DDA和DIA方法鉴定到的肽段、蛋白质和差异蛋白数量

 

接着该团队选择了5种差异蛋白(EBF1, Pax5, TCF3, BCL2 and TNPO3)进行PRM(Parallel Reaction Monitoring)验证,验证结果与DIA结果相吻合。结果表明与EBF1相似,其他B细胞谱系调节因子(例如TCF3和Pax5)的表达也在Ebf1杂合细胞中下调。此外DIA差异表达蛋白的功能性分析显示,EBF1杂合性导致至少八种参与淋巴细胞生成的转录因子的失调,并且导致在pro-B淋巴细胞的存活、发育和分化中起作用的关键蛋白的失调。

 

图2 | 候选蛋白的PRM相对定量验证结果

 

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参考文献

Musa YR et al. Comprehensive Proteomic Investigation of Ebf1 Heterozygosity in Pro-B Lymphocytes Utilizing Data Independent Acquisition. J Proteome Res. 2018 Jan 5;17(1):76-85.

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