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【"营养"猪】文献解读 |丹麦动物研究学家Elham A. soumeh运用LC-MS非靶向代谢组学研究支链氨基酸与动物生长关系

 

前言

现代动物生产中,营养作为物质基础起到了决定性作用。通过营养调控、环境控制等手段可改善动物的健康状况、促进动物生长、生产、繁殖、减少养殖业的环境污染、降低生产成本。本篇由丹麦奥尔胡斯大学从事动物研究的Elham A. soumeh以第一作者发表于Journal of Proteome Research的“Non-targeted LC-MS metabolomics approach for metabolic profiling of plasma and urine from pigs fed branched chain amino acids for maximum growth performance”运用LC-MS非靶向代谢组学技术确认与支链氨基酸摄入水平相关的代谢表型可能与动物生长性能有关。

基本信息

英文标题:Non-targeted LC-MS metabolomics approach for metabolic profiling of plasma and urine from pigs fed branched chain amino acids for maximum growth performance

中文标题:非靶向LC-MS代谢组学方法对喂养支链氨基酸的猪的血浆和尿液进行代谢分析,以获得最大生长性能

材料:猪血浆、猪血清

表期刊:Journal of Proteome Research

运用技术:LC-MS非靶向代谢组学

 

研究背景

支链氨基酸BCAA即亮氨酸(Ile))、缬氨酸(Val)和异亮氨酸(Val),是饮食限制性氨基酸(AA),相对于动物对其的需求,在谷类食物中它们的浓度要低。所以BCAA在其分解代谢途径中具有相同的酶,这导致它们之间具有相互作用,过量的一种BCAA可以增加其他BCAA的分解代谢并改变营养需求。理想的蛋白质是AA概况支持最大的动物生长和最小的氮排放到环境的概念。在这个概念中,所有AA对动物生长具有同样的限制,它们的需求以Lys的百分比表示,因此Lys被定义为参考AA。回肠标准消化率(SID)是目前测定猪营养物质代谢可用氨基酸的最合适方法。实验室以往的剂量反应研究表明,0.52 SID Ile:赖氨酸(Lys),0.70 SID Val:Lys和0.93 SID Leu:Lys分别是支持断奶仔猪获得最佳生长性能的最小Ile,Val需求。目前,还没有关于饮食中BCAA水平提高的代谢反应的数据。一些研究报道了BCAA转氨作用产生的血浆中的AA含量或α-酮酸作为评估日粮中蛋白质质量和AA要求的潜在生物标志物。血浆尿素氮也被用作评估猪日粮蛋白质质量的反应标准。在目前的研究中,假设随着Ile,Val和Leu水平的增加,对猪的代谢谱进行的表征可以揭示与生长性能有关的代谢表型。代谢表型可用于进一步改进估计BCAA需求或蛋白质质量的现有方法。非靶向LC-MS代谢组学已被证明具有反映健康或营养状况的生物液体和组织的代谢表型的潜力。

当给猪喂养最佳水平的BCAA以获得最佳生长性能时,对其血浆和尿液的代谢反应我们尚不清楚,此研究的目的是确认与支链氨基酸摄入水平相关的代谢表型可能与动物生长性能有关。

 

研究思路

 

 

实验方法

1.实验设计

 

a.实验设计

使用96只杂交母猪,分为三组,每组分别在Ile、Val和Leu三个水平进行剂量反应研究,得到AA需求与Lys比值的实证方法。

 

b.样本采集和前处理

用肝素化管采集10ml血液,4℃1020×g离心10min,采集血浆存于-80℃。取200μl血浆,加入600ul乙腈。加入甘氨酸和对氯苯丙氨酸,使之最终浓度为0.03mg/ml,涡旋1min后,4℃静置20min。4℃13200×g离心10min取上清,用真空离心机(Maxi Dry真空浓缩机)蒸发至完全干燥,用200ul水:乙腈:甲酸体积比(95:5:0.1)复溶涡旋后,4℃10621×g离心10min,上清装入HPLC瓶。

用棉垫覆盖的卫生棉条收集尿液,取450ul尿液,加入50ul乙腈,加入与血浆样品相同的IS(内标)至浓度为0.01mg/ml。

 

2.检测方法

 

通过正和负模式的电喷雾电离将洗脱液引入质谱仪中。正负模式的毛细管电压分别为4,500和3,600 V. 在正模式和负模式下,端板偏移电压设置为500 V. 干燥气体流量为10L / min。在200℃的温度下,雾化器压力设定为2.2巴。四极杆全扫描的质荷比(m / z)范围从50到1,000。MS扫描期间的碰撞能量设定为6eV。MS / MS片段化用于鉴定化合物。多反应监测(MRM)扫描的碰撞能量在正模式下为20至35eV,在负模式下为10至30eV,根据所分析化合物的化学特性进行优化。使用甲酸锂作为外标,在每个色谱图开始时用独立的注射泵将其引入质谱仪中。该方法允许每个色谱图的质量校正。

 

实验结果

图1|猪血浆和尿液中SID Ile:Lys增加后代谢物的反应。

 

图2|猪血浆和尿液中SID Val:Lys增加后代谢物的反应

 

图3|猪血浆和尿液中SID leu:Lys增加后代谢物的反应

 

1.动物生长性能

Ile,Val,Leu在Lys中比例的增加对动物生长性能特征的影响,包括平均每日采食量(ADFI),平均日增重(ADG)和饲料效率(G:F),以及在先前的研究中详细报告了拟合数据的统计模型,以便得出关于最小Ile,Val和Leu要求的结论。增长性能表已在补充材料中提供。

血浆和尿液的化学计量学。通过对三项研究的PCA评分图显示,血浆和尿液样品中的实验样品,空白,空白加IS和QC之间的均有合理的分组。数据经过交叉验证,选取RMSE最小时的PLS模型。在所有模型中,PC 1对BCAA水平进行了区分,并解释了大部分的变化。在所有研究均在建立血浆和尿液模型后,观察到实验饮食中明显不同的聚类。

 

2.血浆代谢物

图4|用于Ile(a),Val(c)和Leu(e)血浆PLS模型及其相应回归系数图(b,d和f)

 

图5|血浆中每种饮食的6种颜色代码(TRT)底部的Ile,Val和Leu研究中的BCAA

 

图5中6个TRT分别为在Ile,Val和Leu剂量反应研究中的SID:0.42、0.46,0.50、0.54、0.58和0.62,SID Ile:Lys;0.58、0.62、0.66、0.70、0.74和0.78 SID Val:Lys, SID Leu:Lys分别为0.70、0.80、0.90、1.00、1.10和1.20

在3项研究中,饮食中Ile,Val和Leu水平的升高对代谢体的影响存在差异; 然而,PLS模型显示,随着饲料中BCAA水平的增加,养猪血浆中的主要差异来自AA及其衍生物和胆汁酸。在所有3项研究中,色氨酸(Trp)被鉴定为血浆中的鉴别代谢物,其通过增加SID Ile:Lys和Val:Lys而降低(P = 0.04)并趋于降低(P = 0.08),同时通过增加SID Leu:Lys而趋于降低(P = 0.08)。

在Ile和Leu血浆样品中,3-甲基-2-氧代戊酸是最有鉴别力的鉴定代谢物, SID Ile:Lys增加,3-甲基-2-氧代戊酸(P<0.01)相对增加,随着SID Ile:Lys的增加,络氨酸(P=0.06),次黄嘌呤(P=0.01),吲哚基硫酸(P=0.01)增加。随着SID Ile:Lys的增加,甘氨胆酸(P=0.05),牛磺胆酸(P<0.001)和溶血磷脂酰胆碱(P=0.03)降低并且牛磺熊去氧胆酸(P=0.09)倾向于降低。

在Val研究中,最具鉴别力的代谢物无法鉴定,因为162.0498 m/z组分的数据库中缺乏,随饮食中的SID Val:Lys升高而增加(P<0.001)的MS / MS谱。而随着饮食中的SID Val:Lys的增加,二十二碳六烯酸乙酯(P=0.006)和马尿酸(P <0.04)降低,并且Trp(P=0.08)和花生四烯酸乙酯(P=0.10)趋于降低。

在Leu研究中,PLS模型中最具辨别力的代谢物是3-甲基-2-氧代戊酸,其随饮食中的SID Leu:Lys的增加而降低(P<0.001)。增加SID Leu:Lys就降低了血浆的苯丙氨酸(Phe)(P=0.05),α-酮异戊酸(P=0.002),肌酸(P<0.001)和Ile(P <0.001)。

 

3.尿液代谢物

图6|用于Ile(a),Val(c)和Leu(e)血浆PLS模型及其相应回归系数图(b,d和f)

图7|尿液中每种饮食的6种颜色代码(TRT)底部的Ile,Val和Leu研究中的BCAA

 

PLS回归系数图表明,与血浆代谢谱相似,AA代谢途径中的AA衍生物和小中间代谢物在饲喂SID BCAA:Lys的鉴别力最强。

尿Ile和2-甲基丁酰甘氨酸随着饮食中SID Ile:Lys的增加而增加(P <0.001),是最具鉴别力的代谢物。通过增加饮食中的SID Ile:Lys,苯乙酰甘氨酸(P=0.04)和衣康酸(P=0.01)也增加,尿酸(P=0.10)和3-羟基-3-甲基 - 戊二酸(P=0.10)趋于增加。

在Val研究中,乙酰-DL-亮氨酸是最具辨别力的尿液代谢物,随着饮食中的SID Val:Lys的增加而增加(P=0.004)。随着饮食中的SID Val:Lys的增加,谷氨酸有升高的趋势(P0.08),而肌酸酐(P=0.05)和2-吡咯烷酮(P = 0.05)而降低。

在Leu研究中,通过增加SID Leu:Lys而降低的鉴定代谢物是Ile(P <0.001),谷氨酸(P <0.001),3-羟基-2-甲基丁酸(P <0.001),乙酰-DL-缬氨酸( P<0.001),L-2-氨基己二酸(P <0.001),2-甲基丁酰基甘氨酸(P <0.001)和Tyr(P =0.006)。L-抗坏血酸(P=0.02),胆碱(P=0.005)和胞嘧啶(P=0.009)通过增加饮食中的SID Leu:Lys水平而增加。Soumeh等详细描述了随着每个BCAA水平的提高,动物生长性能的变化特征,其中0.52SID Ile:Lys、0.7SID Val:Lys、0.93SID Leu:Lys被认为是达到动物最佳生长性能的值。

实验结论

①    结果表明,在BCAA中,饲喂不足或足够水平的Leu对血浆和尿液代谢谱的影响更为明显。

②    该结果还证实了Leu对Val和Ile降解的调节作用,这反映在血浆,尿液中的Ile,Val及其相应的α-酮酸浓度上。

③    我们的研究数据表明,在鉴定出的代谢产物中,血浆糖胆酸和牛磺胆酸受SID Ile:Lys的增加影响最大,并且可能与动物的生长性能有关。

④    与生长性能相关的最佳SID Leu:Lys的代谢表型的特征是血浆肌酸和尿中的抗坏血酸升高,尿中2-氨基己二酸和胆碱的排泄减少。

⑤    饮食中Val对血浆和尿液的代谢特征的干预迹象越来越不明显。

⑥    鉴定出的区分代谢物似乎与重要的生物学功能有关,并且可能是健康猪中BCAA摄入量的生物标志物。

 

推荐语

在本次研究中运用LC-MS非靶向代谢组学技术鉴定出的区分代谢物与重要的生物学功能有关,并且可能是健康猪中BCAA摄入量的生物标志物。这是首次通过探索喂养不同BCAA水平的猪饲料的生物液体来鉴定其代谢表型可能与动物生长性能有关。

 

 

 

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上海鹿明生物科技有限公司,一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀,公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台,并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

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