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Nature genetics客户文章 |北京协和医院林东昕教授运用全基因组关联分析和功能表征,鉴定潜在的胰腺癌肿瘤抑制因子研究

 

 

前言

在胰腺癌的研究中,全基因组关联研究已经确定了几个与胰腺癌风险相关的基因位点,然而遗传因素影响散发性胰腺癌发展的机制仍然很大程度上未知。本篇文章由鹿明生物合作客户北京协和医院肿瘤研究所林东昕教授研究组发表在《Nature genetics》(IF:31.616的题为“Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11 degradation”的研究论文,该研究揭示了LINC00673在维持细胞稳态中的重要作用以及其变异如何赋予胰腺癌易感性。本文中用蛋白质组学技术发现了与LINC00673相互作用的蛋白PTPN11,从而阐明了LINC00673的功能机理。

 

基本信息

英文标题:Pancreatic cancer risk variant in LINC00673 creates a miR-1231 binding site and interferes with PTPN11 degradation

中文标题:长链非编码RNA-LINC00673中的一个胰腺癌风险变异为miR-1231构建了结合位点使得PTPN11降解受到干扰

材料:细胞系、小鼠、人胰腺组织、血

影响因子:31.616(发表时期影响因子)

发表期刊:Nature genetics

主要技术:GWAS、qRT–PCR、immunoprecipitation、LC-MS/MS(鹿明生物提供服务支持)

 

研究背景

在过去十年中,发表了1,300多个全基因组关联研究(GWAS),确定了近6,500个与疾病或性状相关的基因位点。然而,只有7%的基因位点位于蛋白质编码区,而93%位于非编码区。蛋白质编码区域的突变通常是非常有害或致命的,因此癌症发展之前这类突变的携带者可能不会存活;然而,调节区域的突变能以细胞类型或组织特异性方式引起基因表达的细微变化,这可能会导致载体对癌症的易感性。LincRNA是非编码转录本,长度超过200 nt,为人类非编码转录组中最大的亚类。越来越多的证据表明lincRNA参与了广泛的细胞过程,其中有研究表明lincRNA在许多人类疾病(包括癌症)中有异常表达且发挥功能。因此,这类基因位点的发现及其生物学功能的阐明有助于理解癌症的病因、促进癌症筛查及开发新治疗方法。本研究在中国人群中鉴定到了LINC00673中rs11655237的突变是胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma , PDAC)易感因素。

 

结果分析

1.含有rs1111655237 [A] 的LINC00673是miR-1231的靶标

作者通过GWAS发现LINC00673的外显子4中rs11655237(G> A)SNP与PDAC易感性相关,qRT–PCR对LINC00673检测表明癌细胞和组织中的LINC00673水平显著低于正常细胞和组织。接着作者推测位于LINC00673中的SNP可能通过创建或破坏某些miRNA的结合位点来影响其水平,通过软件分析发现rs11655237的G> A突变会改变LINC00673的局部折叠结构和自由能,并可能为miR-1231创建结合位点。荧光素酶报告基因测定显示,与具有rs11655237 [G]等位基因的构建体相比,具有rs11655237 [A]等位基因的构建体在miR-1231存在下具有显著降低的荧光素酶活性(图1a)。当miR-1231抑制剂存在时,miR-1231的这种作用可以完全挽救(图1b)。在稳定过表达含有rs11655237[A]或[G]的LINC00673的细胞中,miR-1231仅降低LINC00673 [A]的水平(图1c),表明LINC00673 [A]是miR-1231的靶标。通过qRT-PCR评估rs11655237基因型对PDAC癌旁组织中LINC00673水平的影响(n = 74),结果显示rs11655237的GG基因型个体的LINC00673水平显著高于GA或AA基因型(图1d),而miR-1231的水平在具有不同rs11655237基因型的个体之间非常相似(图1e),表明LINC00673水平的这种基因型特异性差异与miR-1231水平无关。

图1 | rs11655237 SNP的功能相关性

 

2.LINC00673抑制PDAC细胞增殖和细胞周期

作者接着研究LINC00673对细胞表型的影响,发现PDAC细胞系BXPC-3和CFPAC-1(均为rs11655237的GG基因型)中LINC00673 [G]的过表达显著降低了细胞增殖速率(图2a, b),而敲低LINC00673则基本废除了这种效应(图2c, d)。流式结果表明LINC00673 [G]过表达导致PDAC细胞在G0 / G1期大量积累,伴随着S期细胞数量的显著减少(图2e,f), 而其shRNA导致G0 / G1期细胞数量显著减少,但S期细胞数量显着增加。LINX00673 [G]过表达显著抑制BXPC-3和CFPAC-1细胞的集落形成能力,但敲低LINC00673则会显着增加(图2g,h)。小鼠实验发现过表达LINC00673 [G]的异种移植PDAC细胞的生长速度显著低于对照。而敲低LINC00673的异种移植癌细胞的生长速率显著高于对照细胞(图2i,j)。

图2 | LINC00673抑制PDAC细胞增殖和细胞周期进程

 

3.LINC00673促进PTPN11降解

LincRNA可能通过与蛋白质相互作用而发挥功能,作者通过RNA pull down 实验(图3a),得到了LINC00673 [G]-蛋白复合物(图3b)。质谱检测鉴定到多种蛋白,其中丰度最高的蛋白为PTPN11。从质谱结果中选择了丰度前5的蛋白质进行验证,在三次独立的RNA pull down测定中仅检测到PTPN11(图3c)。RNA免疫沉淀结果显示与对照相比,用PTPN11抗体沉淀的复合物中检测出LINC00673的富集(图3d,e),表明PTPN11可能是LINC00673的关键靶蛋白。接着作者探索了LINC00673和PTPN11相互作用的分子结果。结果发现当LINC00673 [G]过表达时,虽然PTPN11 mRNA水平没有改变(图3h),但PTPN11蛋白水平显著降低;当敲低LINC00673时,PTPN11蛋白的水平显著增加(图3i)。用蛋白质合成抑制剂环己酰亚胺处理过量表达LINC00673 [G]的细胞导致PTPN11的半衰期明显短于对照细胞(图3j);相比之下,用蛋白酶体抑制剂MG132处理过量表达LINC00673 [G]的细胞导致内源性PTPN11蛋白水平高于对照细胞(图3k),表明泛素 - 蛋白酶体途径可能在LINC00673介导PTPN11蛋白降解中起关键作用。与对照细胞相比,过表达LINC00673 [G]的细胞中PTPN11的泛素化显著增加,但在敲低LINC00673的细胞中显著降低(图31,m)。这些结果表明LINC00673与PTPN11的相互作用会通过泛素化促进PTPN11的降解。

图3 | LINC00673通过泛素化降解PTPN11

 

4.LINC00673以等位基因特异性方式通过PTPN11降解抑制细胞增殖

在miR-1231存在的情况下,与过表达LINC00673[G]的细胞相比,过表达LINC00673 [A]的细胞具有更快的增殖速率和更强的细胞周期进程(图4a-d),同时在存在miR-1231时过表达LINC00673 [A]的细胞中PTPN11泛素化显著降低(图4e)。进一步检测携带不同rs11655237基因型(n = 35)PDAC癌旁组织中的PTPN11蛋白水平,发现rs11655237的GG基因型个体的PTPN11水平显著低于AA基因型的个体(图4f)。

图4 | LINC00673以等位基因特异性方式通过PTPN11降解抑制细胞增殖

 

5.LINC00673通过PTPN11调节SRC-ERK和STAT1信号

作者接着研究了LINC00673水平变化对PTPN11下游信号传导的影响。先前实验发现LINC00673对细胞增殖和生长的影响,因此作者将研究重点放在参与细胞周期进展的SRC-ERK通路。相对于对照细胞,过表达LINC00673的细胞中磷酸化ERK1 / 2显著降低,且SRC-ERK信号传导下游基因的mRNA和蛋白表达水平发生了改变,包括MYC、cyclin A 和cyclin D 水平的降低和p27水平的增高(图5a)。而稳定敲低LINC00673的细胞中观察到相反的结果(图5b)。LINC00673 [G]的过表达增加了STAT1蛋白和磷酸化STAT1的水平,以及STAT1依赖性干扰素应答基因的mRNA水平(图5c)。LINC00673的敲低降低了STAT1的水平和其下游基因的mRNA水平,并且沉默PTPN11表达克服了这种降低(图5d)。此外通过敲低PTPN11可以再现LINC00673过表达的结果(图5e,f),表明LINC00673的作用是由PTPN11介导的。

 

图5 | LINC00673调节PTPN11下游信号通路

 

 

实验结论

1)通过GWAS分析发现了位于17q24.3的LINC00673与PDAC风险相关。

2)证明LINC00673可以与PTPN11相互作用并促进PTPN11泛素化

3)发现miR-1231可以靶向由rs116552337 G> A突变产生的LINC00673变体,导致细胞中游离LINC00673的水平降低。LINC00673在细胞中的异常表达可导致高水平的PTPN11,从而触发SRC-ERK致癌信号传导,同时减弱STAT1依赖性抗原信号传导(图6)。

图6 | LINC00673在调节PDAC风险中的功能作用

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全基因组关联研究已经确定了几个与胰腺癌风险相关的基因位点,然而遗传因素影响散发性胰腺癌发展的机制仍然很大程度上未知。本文通过使用全基因组关联分析和功能表征,鉴定出一个长非编码RNA(lincRNA)LINC00673是潜在的肿瘤抑制因子,其种系变异与胰腺癌风险相关。LINC00673能够增强PTPN11与E3泛素连接酶PRPF19的相互作用,并通过泛素化促进PTPN11降解,从而导致SRC-ERK致癌信号传导减弱和STAT1依赖性抗肿瘤反应的激活增强。LINC00673的外显子4中rs1111655237的G>A突变会产生miR-1231结合的靶点,其以等位基因特异性方式降低LINC00673的作用,从而赋予对肿瘤发生的易感性。这些发现揭示了LINC00673在维持细胞稳态中的重要作用以及其变异如何赋予胰腺癌易感性。

本文中用蛋白质组学技术LC-MS/MS发现了与LINC00673相互作用的蛋白PTPN11,从而阐明了LINC00673的功能机理,思路值得借鉴。

 

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参考文献

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3.Paraskevopoulou, M.D. et al. DIANA-LncBase: experimentally verified and computationally predicted microRNA targets on long non-coding RNAs. Nucleic Acids Res. 41, D239–D245 (2013).

4.Zhang, J., Zhang, F. & Niu, R. Functions of Shp2 in cancer. J. Cell. Mol. Med. 19, 2075–2083 (2015).

5.Chang, T.H. et al. An enhanced computational platform for investigating the roles of regulatory RNA and for identifying functional RNA motifs. BMC Bioinformatics 14 (suppl. 2), S4 (2013).

 

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