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日常饮食如何改善慢性肾病?质谱技术揭示其中的奥秘

前言

慢性肾病(Chronic Kidney Disease, CKD)在全球影响了近8.5亿人。尽管饮食调整(dietary modification)是目前慢性肾病治疗的基本准则之一,但日常饮食与肠道菌群是如何相互调节(interaction)的,其调节机制对慢性肾病的病理过程和治疗的影响依然不清楚。已有的报道已证实了饮食中的蛋白质对慢性肾病的影响,具体的说,通过摄入含硫氨基酸(Sulfur-containing amino acid, Saa)的饮食,可以改善慢性肾病的症状,但其具体机制依然未知。
 

近日,来自哈佛大学医学院的科学家们在Science杂志中发表了关于慢性肾脏病与肠道菌群的研究成果,利用微生物16S+质谱技术揭示了含硫氨基酸饮食是如何与肠道菌群相互作用的(1),这个范例引入了全新的思路。作者指出饮食变化可以触发微生物蛋白的翻译后修饰,从而改变尿毒症毒素的形成,从而影响慢性肾脏疾病的进展。这些发现可能有助于慢性肾脏病的治疗,并为改善人类健康提供了针对微生物群及其蛋白质组酶活性的临床方法。
 


英文标题:Diet posttranslationally modifies the mouse gut microbial proteome to modulate renal function

研究对象:慢性肾病的模型小鼠

发表期刊:Science

影响因子:41.845

单位:哈佛大学医学院

发表时间:2020年9月

运用生物技术:质谱分析(LC-MS/MS)、定量蛋白质组学、细菌16srRNA基因扩增子序列
 

研究方法及结果
 

为了验证含硫氨基酸的摄入可以改善慢性肾病,作者利用慢性肾病的模型小鼠进行验证。以小鼠血清中的肌酐(serum creatinine)含量和肾脏的组织切片为评价标准,作者比较了无特定病原体(Specific-pathogen-free, SPF)的小鼠在两种Saa摄入条件下(高Saa+Ade与低Saa+Ade,其中Ade(腺嘌呤)的加入为排除蛋氨酸的干扰)的血清肌酐含量和病理切片,证实了低Saa摄入会增加血清肌酐含量,导致更严重的肾脏病理变化。
 

随后,为了验证Saa效应与肠道菌群的关系,无菌(germ-free, GF)条件下的小鼠也被纳入了比较。与SPF小鼠相似的是,低Saa饮食能减少其血清肌酐含量,降低肾脏损伤(图1) ;
 

有趣的是,GF小鼠也会产生肾损伤,进一步的基因测序表明,SPF小鼠与GF小鼠的肠道菌群存在差异。总体而言,低Saa饮食会导致CDK临床表型恶化,而肠道菌群会进一步放大这些影响。
 

图1 | 高/低Saa饮食条件下不同小鼠(SPF,GF,ASF)血清肌酐含量与肾脏组织切片比较

高Saa饮食的核心是增加含硫蛋白质的摄入,含硫蛋白质在体内通过肠道微生物代谢可以产生H2S(hydrogen sulfide),吲哚(indole)和吲哚酚硫酸盐(indoxyl sulfate) 。其中吲哚和吲哚酚硫酸盐可以导致尿毒症,而H2S的具体机理还未被证实。作者希望通过测定H2S含量来验证Saa饮食与肠道菌群中间的联系,测定表明,高Saa饮食的SPF小鼠肠道H2S含量高于低Saa饮食;无论Saa饮食如何,GF小鼠的H2S含量均小于SPF小鼠。有趣的是,尽管H2S含量不同,但SPF小鼠在不同Saa饮食条件下的肠道菌群种类却没有变化。
 

鉴于肠道菌群的种类没有变化,作者希望从肠道菌群的含量变化上寻找线索。通过对公开数据的分析,大肠杆菌成为重点关注的对象。作者对实验小鼠种植了改良后的Schaedler菌群(altered Schaedler flora, ASF)并进行了与SPF小鼠相同的实验,证实了大肠杆菌与Saa的相互作用并可减少肾脏损伤,并推测其中起到联系作用的就是H2S含量。
 

根据现有的报道,H2S可以导通过修饰蛋白质侧链的半胱氨酸残基发挥作用,称为S-硫酸化(S-sulfhydration)。基于此报道,作者希望通过对大肠杆菌中的S-硫酸化的蛋白质进行富集并鉴定,从而揭示Ssa与大肠杆菌相互作用的分子机理。由于S-硫酸化是蛋白质的侧链产生一个巯基的变化,因此会有32 Da的质量变化,这样通过质谱技术就可以很容易鉴定出S-硫酸化的蛋白质。通过基于质谱的定量蛋白质组学分析,作者共鉴定出212种S-硫酸化蛋白质。
 

在这些蛋白质中,色氨酸酶(Tryptophanase ,TnaA)值得引起重视。TnaA是一种分泌酶,可以将色氨酸降解为吲哚,丙酮酸和氨,而吲哚已证实参与细菌与宿主的相互作用。基于此,TnaA有望成为CKD模型中宿主与微生物相互作用的靶点。作者随后通过基因技术将大肠杆菌中的TnaA基因替换为TnaA-His,并通过West Blot(WB)实验证实了其表达的TnaA的S-硫酸化程度降低。但是由于TnaA蛋白质存在7个半胱氨酸残基,WB技术无法确定S-硫酸化降低发生在哪个半胱氨酸残基上。串联质谱技术可以通过MS2碎片的分析,对翻译后修饰的位置进行定位。 作者通过质谱技术,确定了其中6个位置的半胱氨酸发生了变化(图2),其中C298尤其值得关注,文献报道C298突变可以导致TnaA活性的改变。
 

图2 | 代表性的S-硫酸化MS2图谱
 

随后,为了建立S-硫酸化与TnaA活性之间的定量变化,作者液相色谱-串联质谱(LC-MS/MS)技术对吲哚浓度进行分析,证实了半胱氨酸可以降低吲哚浓度。综合所有的实验,可以证实吲哚可以降低大肠杆菌的TnaA的S-硫酸化程度,从而减低其活性。
 

为了进一步验证该机理,作者为ASF小鼠提供了高/低Ssa饮食,并对小鼠盲肠中的TnaA硫酸化程度进行了测定,发现高Ssa饮食导致了TnaA硫酸化程度增加,由于ASF小鼠本身不含tnaA基因,同时LC-MS/MS技术在小鼠盲肠中没有检测出吲哚,从而证实了大肠杆菌是该调节机制中产生吲哚的菌种。基于该推测,作者将将大肠杆菌植入ASF小鼠,并测定了两种Ssa饮食条件下盲肠吲哚的含量,发现高Ssa饮食可以导致吲哚水平明显降低,表明高Ssa饮食不仅可以增加TnaA硫酸化程度,而且可以影响体内TnaA的活性。随后GF小鼠也被纳入到实验中。总体而言,所有的数据支持饮食成分可以产生影响肠道外宿主功能的肠道微生物蛋白的翻译后修饰,为关于宿主-饮食-微生物群相互作用如何导致疾病状态(例如CKD)的机制提供了新的见解。
 

研究结论
 

结合所有的实验,可以证实饮食是控制CKD的关键方面。而TnaA抑制剂(例如硫化物供体)可能有助于降低肠道吲哚水平,从而减轻肾脏损害,这些发现可能有助于CKD的治疗,并为改善人类健康提供了针对微生物群及其蛋白质组酶活性的临床方法。
 

小鹿贴士
 

1.由于质谱技术是基于分子量变化的技术,因此只要发生了质量上的变化,所有的翻译后修饰理论上均可以利用质谱技术进行鉴定。

2.质谱技术还可以通过MS2碎片分析,对翻译后修饰的位置进行推测,提供更为准确的位置信息。

3.通过与色谱利用,LC-MS或LC-MS/MS技术可以对化合物进行定量/半定量分析。
 

文末看点
 

这篇Science文章引入了全新的思路,利用微生物群及蛋白质组学方法对慢性肾脏病与肠道菌群的研究。鹿明生物在组学研究方面也推出了一系列的多组学组合产品,16S+代谢组学就是其中的热门,鹿明生物合作客户已在GUT等热门期刊发表了文章
 

参考文献:

1.L. Lobel, Y. G. Cao, K. Fenn, J. N. Glickman, W. S. Garrett, Diet posttranslationally modifies the mouse gut microbial proteome to modulate renal function. Science 369, 1518-1524 (2020).
 

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文章来源于鹿明生物