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文献解读 | 国家蛋白质科学中心于晓波教授合作团队利用DIA技术鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物

 

前言

严格说来:人体各系统器官的疾病都可以在血液当中有一定的呈现,通过测定血液中的蛋白可反映病人的生理病理状态。因此,运用质谱技术来测定蛋白定量的准确性和重现性成了研究的焦点。2019年4月13日,发表在《Theranostics》上由国家蛋白质科学中心的于晓波教授、广东省中医院卢传坚教授、西湖大学郭天南研究员和南京大学许丹科教授等合作发表的In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin,详细的总结了运用DIA技术对血液标志物进行探索,进一步的验证DIA 技术在定量的准确性和重现性的优势

基本信息

英文标题:In-depth serum proteomics reveals biomarkers of psoriasis severity and response to traditional Chinese medicin

中文标题:血清蛋白质组学鉴定银屑病及其中药疗效的生物标志物

材料:血清

影响因子:8.712   

发表期刊:Theranostics 

主要运用技术:DIA技术、抗体微阵列

 

研究背景

血液中的蛋白可反映病人的生理病理状态,随着质谱技术的发展,有着更高定量准确性和重现性的DIA (Data Independent Acquisition)技术,可在血液中鉴定到数百种蛋白。同时抗体微阵列技术有着较高的灵敏度,可对质谱无法检测到的低丰度蛋白定量。本文结合这两种技术,对银屑病患者的血液标志物及其对中药响应的标志物进行了探索。

 

研究思路

图1 | 实验设计

 

(一)实验分组

实验收集临床血清样本,分为发现集和验证集:

1)  发现集对照组:16例健康人血清;

2)发现集银屑病患者组:23例银屑病患者血清;

3)  发现集银屑病治疗组:11例经12周银屑病治疗的患者血清;

4)  验证集健康对照组:20例健康人血清;

5)  验证集疾病对照组:10例荨麻疹患者血清;

6)  验证集银屑病患者组:50例银屑病患者血清。

 

(二)检测方法

1)  抗体微阵列:通过文献挖掘设计银屑病相关蛋白的抗体微阵列,用以检测血清蛋白质。

2)  质谱DIA技术:检测银屑病血清蛋白质组。

3)  ELISA验证候选蛋白。

 

结果分析

1. 银屑病抗体微阵列的设计与制作

通过文献挖掘,共找到129种与银屑病相关的血液蛋白。基于这些蛋白的抗体制作抗体微阵列(图2A),对16例健康人血清、23例银屑病患者血清、11例经12周银屑灵治疗的银屑病患者血清进行蛋白质检测,发现抗体微阵列检测血清蛋白的重现性较高(图2B)。对比银屑病患者血清和健康人血清,发现除了已知的银屑病标志物外,还鉴定到新的在银屑病患者血清中发生丰度变化的蛋白(图2C、图2D)。

图2 | 设计和制作银屑病特异的抗体微阵列

 

2.建立银屑病血清蛋白质表达谱

本部分通过QE-HF质谱仪对各组血液样本进行DIA检测(图3A),共鉴定到283个特异性肽段。对DIA技术进行重复性评价,结果表明样本间的Pearson相关系数均值为0.85(图3B),平均变异系数为4.17%(图3C)。对银屑病患者组和健康对照组进行比较发现58种差异蛋白(图3D),其中有已知的炎症和凝血相关蛋白(图3E)。

图3 | DIA检测银屑病患者血清蛋白

 

接着作者通过对比血浆蛋白质组数据库(human plasma proteome database),发现DIA技术鉴定到的蛋白浓度范围为106- 1010pg/mL,抗体微阵列鉴定到的蛋白浓度从100- 106 pg/mL,两者结合共得到跨越近10个数量级浓度范围的蛋白质(图4A)。生物信息学分析表明DIA检测到的蛋白质富集酶调节、防御免疫和凝血通路,抗体微阵列检测到的蛋白质富含信号分子和CCKR、P53、白细胞介素和激素受体通路(图4B)。

图4  | 结合DIA-MS和抗体微阵列技术开发血清蛋白质组学平台

 

3.临床指标、血清蛋白质组和银屑病严重程度的相关性分析

为了进一步说明血清蛋白质组的临床实用性,作为分析了临床指标、血清蛋白质组和银屑病指标间的相关性(图5A、图5B),发现了三个血清蛋白(PI3, CCL22, IL-12B)与银屑病指标正相关(图5C)

 

图5 | 血清蛋白质组、临床指标和银屑病指数的相关网络

 

4. 鉴定银屑病生物标志物

经统计分析,58个差异蛋白(P <0.01)可显著区分银屑病患者和健康对照(图6A),基于这些差异蛋白进行主成分分析,也同样可区分两组(图6B),其中一个蛋白PFN1在DIA和抗体两种技术的定量结果中,均在银屑病患者和健康对照组中有显著差异(图6C)。在发现集和独立验证集中,用ELISA技术对PI3进行验证,结果均表明其在银屑病患者组中高表达。说明其找到的差异蛋白可能成为银屑病的潜在标志物。

 

图6 | 定银屑病诊断蛋白

 

为了发现可用于预测银屑病治疗效果的标志物,作者选取了11例银屑病患者,经12周的银屑灵治疗,结果有6例患者治疗有效,5例患者治疗无效(图7A)。对药物治疗前的治疗有效组(n = 6)和治疗无效组(n = 5)患者血清蛋白进行比较分析,发现了12种差异表达的蛋白(p<0.05)(图7B)。对这些蛋白在治疗后的表达值进行检测,发现有效组中FCN2,MIF和MMP1的血清丰度一致高于无效组(图7C),表明其可作为预测银屑灵治疗效果的潜在生物标志物。

图7  | 鉴定可用于预测银屑灵治疗银屑病疗效的血清蛋白

 

实验结论

1)结合DIA和抗体微阵列技术,建立可检测丰度跨越10个数量级的血清蛋白谱。

2)对银屑病血清蛋白质组分析,发现了其潜在的生物标志物,并在独立验证集中对PI3进行了ELISA验证。

3) 结合临床分析表明其建立的血清蛋白质组平台在转化医学、精准医疗领域中具有很大的应用潜力。

 

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血液中包含了丰富的生理、病理信息,是疾病生物标志物研究领域的重要材料。然而血液蛋白浓度动态范围广、高丰度蛋白含量高,导致血液蛋白质组鉴定难度大。本文通过DIA技术和抗体微阵列技术,以银屑病为疾病模型,对银屑病治疗前、银屑病中药(银屑灵)治疗后、健康对照共50例血清样本建立蛋白质表达谱。鉴定到了106种参与血液凝固、炎症、细胞凋亡和血管生成等银屑病相关生物过程的差异蛋白。聚类和主成分分析发现58种蛋白可区分健康组和银屑病患者,12种蛋白可预测中药治疗效果,相关性分析发现三个血清蛋白(PI3,CCL22,IL-12B)与银屑病面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index, PASI)评分呈正相关。质谱DIA技术适合大规模临床样本的检测,抗体微阵列技术可补充质谱无法鉴定到的血清低丰度蛋白,本文结合DIA技术和抗体微阵列技术研究血液生物标志物的思路值得借鉴。

 

部分参考文献

 

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