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FRONT MICROBIOL|赵冬敏博士运用LC-MS/MS鉴定GRP78是鸭Tembusu病毒感染BHK-21细胞的受体研究

LC-MS/MS鉴定:是目前使用最广泛的蛋白质组学研究手段,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE,Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis)分离蛋白质混合物,收集目的胶条,经胶内酶解后用于质谱分析以获得蛋白质信息。

 

目前,LC-MS/MS技术被广泛的用于做CO-IP、Pull down及做抗体的科研工作者。不少科研者因其周期短、技术成熟、高灵敏度,可用于复杂样本而选择运用此项技术,其中不少医学、植物学、动物学等科研研究者通过运用此项技术发表了不少的高分文章,以下为一篇依据LC-MS/MS技术探究病毒机理的文章,此文章为中国水禽养殖业的病毒研究提供了重要研究依据。

 

前言

Tembusu病毒(TMUV)是一大群具有包膜的单正链RNA病毒。该类病毒通过吸血的节肢动物(蚊、蜱、白蛉等)传播而引起感染。在我国,Tembusu病毒(TMUV)的爆发和传播给中国水禽养殖业带来了巨大损失。本篇文章由江苏省农业科学院兽医研究所赵冬敏博士为第一作者,发表在Frontiers in Microbiology杂志发表题为“Identification of Glucose-Regulated Protein 78 (GRP78) as a Receptor in BHK-21 Cells for Duck Tembusu Virus Infection”的研究论文,该研究报道了BHK-21细胞中TMUV结合分子的探究。

研究背景

自2010年以来,Tembusu病毒(TMUV)在中国许多省份引起严重鸭病并快速传播。Tembusu病毒属于黄病毒属,是由三种结构蛋白(包膜[E],衣壳[C]和膜[M])和七种非结构蛋白组成。黄病毒的E蛋白主要作为受体结合蛋白起作用,其是毒力、细胞向性和宿主范围的主要决定因素。作为包膜病毒,黄病毒感染的第一步涉及E蛋白与宿主细胞受体之间的结合。黄病毒可识别单个细胞表面分子或利用多种受体进入细胞。随后,黄病毒通过网格蛋白介导的内吞作用进入细胞并被递送至内体。内体的酸性条件触发E蛋白介导的病毒和内体膜之间的膜融合。最后,形成融合孔并将核衣壳释放到胞质溶胶中。近年来,已经鉴定了多种结合因子,表明黄病毒可以使用多种受体用于细胞进入,其是菌株特异性和/或细胞类型依赖性的。然而,BHK-21细胞中TMUV结合分子仍不清楚。

 

实验方法

1. IP LC-MS/MS鉴定病毒结合受体

2. Western Blot和免疫荧光检测受体表达情况

3.敲低、过表达功能实验

 

结果分析

1. 鉴定GRP78是TMUV结合的膜蛋白

使用病毒覆盖蛋白结合测定来初步鉴定参与TMUV结合的BHK-21细胞中的分子。观察到约70kDa的独特病毒结合条带。在缺失TMUV时,TMUV单抗不能检测特异性结合带(图1A)。通过质谱鉴定,在70kDa条带中鉴定到了9种蛋白质。其中八种蛋白质参与细胞代谢和细胞骨架。由于GRP78已经被鉴定为日本脑炎病毒和DENV的受体,作者决定研究GRP78是否在TMUV与细胞结合中发挥作用。如图1所示,抗GRP78抗体可以特异性识别70kDa蛋白质条带,进一步证实TMUV和GRP78之间的相互作用。

 

图1 |鉴定GRP78是TMUV结合的膜蛋白

 

 

2.GRP78的抗体竞争性抑制TMUV进入

BHK-21细胞与针对GRP78的N-或C-末端结构域的抗体预孵育,然后进行TMUV感染。在N-末端GRP78抗体处理的细胞中,病毒RNA水平显着低于非特异性兔IgG处理的细胞,表明N末端GRP78抗体可显着降低病毒结合。然而,C末端GRP78抗体未能影响病毒结合(图2)。

 

图2 |抗GRP78抗体抑制BHK-21细胞中的TMUV感染

 

 

3. GRP78在BHK-21细胞表面表达且与TMUV共定位

传统上,GRP78被认为是内质网腔内蛋白质。最近的研究表明GRP78也在细胞表面表达。为了验证GRP78在BHK-21细胞表面上的表达,分离来自BHK-21细胞的膜蛋白和胞质蛋白,并进行蛋白质印迹分析。Western blot结果显示GRP78可在BHK-21细胞表面表达(图3A)。接着作者用间接免疫荧光测定法观察GRP78和TMUV在BHK-21细胞中的共定位。结果显示GRP78与BHK-21细胞表面上的TMUV共定位(图3B)。

 

图3 | GRP78和TMUV在BHK-21细胞表面的共定位

 

4.BHK-21细胞中GRP78的RNA干扰抑制TMUV感染

为了进一步证明GRP78在TMUV结合和进入细胞中的作用,通过shRNA降低GRP78蛋白在BHK21细胞中的丰度。qRT-PCR表明在BHK-21细胞中GRP78的mRNA水平被显着抑制(图4A)。纯化转染细胞的细胞表面蛋白并进行蛋白质印迹分析,结果显示表面GRP78蛋白质丰度降低约70%(图4B)。与用空载体转染的细胞相比,GRP78 shRNA转染的细胞其TMUV RNA水平显著降低(约60%)(图4C)。这些结果表明GRP78在TMUV结合和进入BHK-21细胞的过程中起重要作用。

图4 | GRP78 shRNA转染48小时后对TMUV进入的影响

 

5.BHK-21细胞中过表达GRP78会提高TMUV感染

作者接着发现过表达GRP78的细胞中,其TMUV RNA水平显着增加(图5)。通过敲低、过表达功能实验证明GRP78蛋白支持TMUV进入BHK-21细胞。

图5 |GRP78过表达48小时后对TMUV进入的影响

 

实验结论

本文首次鉴定GRP78是BHK-21细胞感染TMUV时的受体。GRP78参与TMUV受体结合并进入BHK-21细胞,表明其在病毒感染中的重要作用。GRP78的鉴定可更好地了解TMUV发病机制。此外,GRP78对TMUV感染的多重关键作用可能为抗病毒药物设计提供新的靶标,并提供有关TMUV预防和控制的其他信息。

 

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Tembusu病毒(TMUV)的爆发和传播给中国水禽养殖业带来了巨大损失。本文研究中,作者用过蛋白质组学质谱鉴定技术确定GRP78蛋白是鸭TMUV感染的BHK-21细胞中的受体。文章首先使用来自BHK-21细胞的细胞膜,通过病毒覆盖蛋白结合试验(VOPBA)观察到约70kDa的TMUV结合蛋白。免疫共沉淀结合LC-MS/MS鉴定GRP78为与TMUV相互作用的蛋白质。GRP78抗体可抑制TMUV与BHK-21细胞表面的结合。间接免疫荧光显示GRP78与TMUV在细胞表面共定位。此外,功能实验表明敲低/过表达GRP78会抑制/增加TMUV感染。这些结果表明GRP78是参与TMUV进入的新型宿主因子。本文通过蛋白质组学质谱技术鉴定病毒结合受体的思路值得借鉴使用,本文蛋白鉴定部分由上海鹿明生物科技有限公司协助完成。

 

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