企业新闻

坚持“以先进的科学技术,创一流产品质量;以诚信周到的服务,满足顾客的要求

Nature | 最新发现!癌细胞转移的奥秘

前言

 

2020年8月美国德克萨斯大学西南医学中心儿童研究所在Nature发表题为“Lymph protects metastasizing melanoma cells from ferroptosis”(淋巴可保护转移性黑色素瘤细胞免于铁死亡)的研究成果,通过代谢组学等多项研究方法,首次揭示了淋巴保护癌细胞免于铁死亡,形成更多远处转移的深层机制。

 

 

中文标题:淋巴可保护转移性黑色素瘤细胞免于铁死亡

研究对象:小鼠、黑色素瘤

发表期刊:Nature

影响因子:46.686

运用生物技术:非靶向代谢组学、脂质靶向组学

 

研究背景

 

远处转移之前,黑色素瘤和上皮癌通常在引流淋巴结中形成转移。对人类和小鼠癌症(包括黑色素瘤)的遗传研究表明,局部淋巴结转移有时会引起远处转移。淋巴结中的癌细胞也可以迁移到血管通过血液转移。但尚不清楚远处转移的细胞是直接从原发性肿瘤进入血液还是在进入血液之前先通过淋巴系统迁移。越来越多的证据表明,淋巴系统促进癌细胞的迁移和存活。与静脉注射相比,一些癌细胞被注射入淋巴结后形成更多的肿瘤。血管内皮生长因子C(VEGF-C)和各种趋化因子促进癌细胞向淋巴管的迁移。代谢脂肪酸的能力促进了癌细胞在淋巴系统中的存活以及转移性肿瘤的形成。

 

以往的研究中,主要在血液中表征循环的癌细胞,关于淋巴管的癌细胞信息很少。尽管一些癌细胞在进入血液并形成远处转移之前会通过淋巴管迁移,但尚不清楚暴露于淋巴中是否会影响它们在血液中的存活。癌细胞通过血液转移的效率极低,限制癌细胞存活的一个因素是氧化应激,但氧化应激杀死转移细胞的机理尚不清晰。脂质氧化可引起铁死亡(一种新发现的细胞死亡模式),其原理是磷脂中的多不饱和脂肪酸被具有氧化-还原活性的铁氧化。但大多数铁死亡研究都在培养物中进行的,限制了对铁死亡影响体内癌细胞生长的理解。

 

研究思路

 

 

研究方法

 

1、获得黑色素瘤单细胞样本并对小鼠进行异种移植肿瘤实验

 

2、铁死亡调节剂对体外黑色素瘤细胞作用的测试实验

(1)铁死亡调节药物对黑色素瘤细胞形成皮下肿瘤能力影响的测试;

(2)其他抑制剂对黑色素瘤细胞存活和形成远处转移能力影响的测试;

(3)铁死亡调节药物对黑色素瘤细胞存活或静脉/淋巴结内注射后形成肿瘤能力的测试;

(4)油酸对肿瘤转移影响的测试;

 

3、培养物中铁死亡调节剂作用的测试

(1)培养过程中黑色素瘤细胞是否铁死亡的测试;

(2)脂肪酸对培养的黑色素瘤细胞铁死亡影响的测试;

(3)铁螯合剂的影响测试;

 

4、生物发光成像

通过生物发光成像(黑色素瘤稳定表达的荧光素酶)评估转移性疾病负担;

 

5、其他检测

(1)流式细胞仪分离与分析黑色素瘤细胞;

(2)ELISA定量测定8-OHdG水平;

(3)分光光度法测定小鼠血浆和淋巴液中铁含量;

(4)小鼠黑色素瘤的遗传修饰;

(5)qRT–PCR分析比较FSP1转录水平;

(6)黑色素瘤的蛋白质印迹分析;

(7)从血浆和淋巴液中分离ApoB+和ApoB-组分;

 

6、代谢组学研究

(1)高分辨质谱非靶向代谢组学分析;

(2)基于LC–MS / MS的靶向代谢组学分析GSH / GSSG;

(3)脂质组学的分离与质谱检测,油酸含量分析;

 

研究结果

 

1.黑色素瘤细胞在淋巴中的存活率增加

 

通过皮下、静脉和淋巴结向NSG小鼠有效和低效转移黑色素瘤(表1)。在NSG小鼠异种移植后,有效转移会自发引起血液中循环的癌细胞和远处转移,而效率低的转移产生这种效果更有限(附表1a)。生物发光成像分析结果表明(附图1),NSG小鼠经过皮下注射后,人类黑色素瘤细胞中平均有1/6-1/14形成肿瘤(表1),静脉内注射形成转移性肿瘤的细胞要少得多。注入淋巴结后形成肿瘤的细胞比例高于静脉注射。而且与静脉注射相比,淋巴结注射会产生更远的转移。

 

表1 | 与静脉注射相比,人和小鼠黑色素瘤细胞更容易在淋巴结内形成远处转移

 

 

附表1 | 人和小鼠黑色素瘤的表征

 

 

注入腘窝淋巴结比皮下或静脉内注射后形成肿瘤的黑色素瘤细胞多(表1)。另外与静脉内注射相比,淋巴结内注射引起的转移更远,结节内注射后黑色素瘤细胞存活和形成转移性肿瘤明显优于静脉注射(表1)在人类和小鼠黑色素瘤中,每微升肿瘤引流淋巴中黑色素瘤细胞明显多于肿瘤引流血液(图1 a&b)。另外血液比淋巴液氧化性更高,可以解释血液中黑色素瘤细胞中ROS水平的升高。

 

图1 | 与血液相比,淋巴中的黑色素瘤细胞受到的氧化应激作用更少

 

附图1 | 流式细胞术可从血液和淋巴中分离出黑色素瘤细胞,生物发光图像可以量化内脏器官的转移性疾病负担

 

2.黑色素瘤细胞在血液中发生铁死亡

 

通过皮下注射将人和小鼠黑色素瘤分别移植到NSG和C57BL小鼠中,使其自发转移。相比皮下或淋巴,大多数人和小鼠血液中的黑色素瘤细胞明显表现出更高的脂质ROS水平(图2a&b)。为测试黑色素瘤是否会发生铁死亡,作者使用Erastin激活素(通过抑制摄取胱氨酸激活)和/或liproxstatin-1抑制素(通过减少脂质过氧化物积累抑制)培养细胞。相对于对照培养物,Elastin显著减少了细胞数量,而liproxstatin-1阻止了这种作用(图2c/d)。铁可促进脂质ROS的生成,是铁诱导的细胞死亡所必须的因素。血浆中的游离铁浓度比淋巴液中高得多(图2e)。

 

图2 | 与淋巴相比,血液中铁死亡的黑色素瘤细胞增加

 

为确定铁死亡是否会限制血液中黑色素瘤细胞的存活,用liproxstatin-1预处理黑色素瘤细胞,然后移植到小鼠静脉中。liproxstatin-1预处理在有效转移人和小鼠(图2f/g)的黑色素瘤中显著增加转移性疾病负担,经过同样预处理的无效转移黑色素瘤转移性疾病负担没有明显增加(附图2i)。为了测试铁死亡的重要性,作者从两种小鼠黑色素瘤中敲除了谷胱甘肽过氧化物酶4(Gpx4)的基因(附图3a)。在体内,缺乏Gpx4显著增加皮下肿瘤中脂质ROS的水平(附图3e)。缺乏Gpx4仅稍微降低了原发性皮下肿瘤的生长(附图3f/g),显著降低血液中黑色素瘤细胞(附图3h/i),以及自发在内脏器官中形成转移性肿瘤的小鼠百分比(图2l)。

 

附图2 | liproxstatin-1对皮下肿瘤生长的影响以及其他抑制剂对转移的影响

 

附图3 | Gpx4缺失对培养的小鼠黑色素瘤存活和增殖的影响

 

3.油酸可预防铁死亡的发生

 

作者在小鼠皮下移植了黑色素瘤,使其自发转移。从同一只小鼠的血液和淋巴中分离出细胞,进行非靶向代谢组学分析。主成分分析表明,淋巴与血液中的黑色素瘤细胞各自聚集在一起(图3a)。与来自不同患者的黑色素瘤细胞相比,来自淋巴和血液的黑色素瘤细胞之间的差异更大。对鉴定出的代谢产物进行了途径富集分析发现,排名前五的途径中有三种与脂质代谢有关(图3b)。磷脂的脂肪酸组成影响癌细胞对铁死亡的敏感性,在作者鉴定出57种脂质中,油酸在淋巴瘤和血液黑色素瘤细胞间差异最大。油酸在淋巴和血液中含量较高,并在淋巴黑色素瘤细胞中富集。

 

作者用油酸或亚油酸(一种多不饱和脂肪酸)处理小鼠和人类黑色素瘤细胞12小时,然后使用了Erastin激活素处理24小时,最后对活细胞计数。油酸或亚油酸本身对细胞计数的影响很小,但在人类和小鼠黑色素瘤中(图3c&d),Erastin显著降低了细胞计数,油酸(而不是亚油酸)可保护细胞免受Erastin破坏,这表明油酸可以保护黑色素瘤细胞免于铁死亡。为了考察油酸在转移过程中是否能促进黑色素瘤细胞的存活,作者用油酸,亚油酸和载体处理培养的黑色素瘤细胞12小时,然后在小鼠静脉内注射了相同数量的活细胞。实验结果表明用油酸处理可提高黑色素瘤在通过血液转移过程中存活的能力。

 

图3 | 淋巴和淋巴中黑色素瘤细胞的油酸水平较高/油酸可预防铁死亡

 

作者对血浆进行了靶向脂质组学分析(附表2),在分析的121种脂质中,淋巴液和血浆之间存在显著差异(附图4a/b),包括15种在淋巴含量更高的三酰基甘油和22种在血浆含量更高的磷脂。游离油酸在淋巴和血浆中含量极低,且无明显差异。在小鼠淋巴中,三酰甘油和磷脂的油酸总含量比在血液中高(图3g/h)。

 

附表2 | 质谱分析的脂质种类清单

 

附图4 | 血浆和淋巴中的脂质种类

 

淋巴液的油酸大多在三酰基甘油中,而血浆的油酸通常在磷脂中。经实验验证几乎所有的三酰基甘油和油酸都包含在ApoB+囊泡中,与血浆相比,淋巴中ApoB+的油酸含量更丰富(附图4c/d)。ACSL3(酰基辅酶A合成酶长链家族成员3)将脂肪酸转化为脂肪酰基辅酶A酯进而与膜磷脂结合,进而保护培养物中细胞免受铁死亡。为测试油酸是否需要ACSL3保护细胞免于铁死亡,作者先用油酸将ACSL3缺失或对照组黑色素瘤处理12小时,然后用Erastin激活素处理24小时,最后对活细胞计数。发现油酸可阻止Erastin激活素影响对照组细胞(图3d),但不能保护缺失ACSL3的细胞(图3i/j)。油酸以ACSL3依赖方式阻断了Erastin对黑色素瘤细胞的作用。与对照组细胞相比,向结内注射ACSL3缺失的细胞导致转移性疾病显著减少(附图5i)。

 

 

附图5 | ACSL3在油酸结合磷脂以及油酸对铁死亡的保护是必需的

 

作者还测试了SLC7A11(半胱氨酸和谷氨酸转运蛋白)、ACSL4(用于脂质生物合成的酯化长链脂肪酸)和FSP1(铁死亡抑制蛋白1)的表达,它们均可影响铁死亡的敏感性。作者观察到淋巴与血液中黑色素瘤细胞中FSP1(也称为AIFM2)的转录水平没有差异(附图6 g)。黑色素瘤表达了多种能够转运油酸的脂肪酸转运蛋白(附图6h)。

 

附图6 | 黑色素瘤细胞中潜在铁死亡调节剂的表达

 

4. 淋巴可保护细胞免受铁死亡的侵害

 

之前结果说明淋巴结转移可能先于远处转移,因为在淋巴中暴露使油酸能够与细胞磷脂结合,或渗入其他抗氧化剂,在血液传播过程中保护细胞免受铁死亡。为了考察差异是否可逆,作者从原发性皮下肿瘤和淋巴结中分离黑色素瘤细胞,先将其皮下移植,然后再静脉内移植,另外淋巴结转移的黑色素瘤细胞通常比来自皮下肿瘤的细胞对Erastin更具抗性(图3l/m)。静脉内注射实验表明,癌细胞有可能不依赖淋巴,通过血液转移,但这种转移途径比淋巴转移效率低得多(表1)。

 

作者研究的大多数黑色素瘤用油酸处理后形成更多的转移灶,这表明存在一些机制可保护某些黑色素瘤免受淋巴中的氧化应激,而这些机制可能包括其他抗氧化剂水平升高、内源性脂肪酸的产生或FSP1介导的机制,与外源性油酸无关。总之在淋巴液中,细胞可通过降低氧化应激提高随后血液迁移过程中的细胞存活率,来保护转移细胞免于铁死亡(附图6j)。

 

研究结论

 

研究结果表明,淋巴中的黑色素瘤细胞比血液中经历较少的氧化应激并形成更多的转移。在具有患者黑色素瘤且免疫功能低下的小鼠和具有小鼠黑色素瘤且有免疫功能的小鼠的肿瘤引流淋巴中,每微升黑色素瘤细胞多于肿瘤引流血。静脉内(而不是淋巴)注射后,用化学类铁死亡抑制剂预处理的细胞比未处理的细胞形成更多的转移。与血浆相比,淋巴液中谷胱甘肽和油酸水平升高、淋巴中游离铁减少,可能导致氧化应激和铁死亡降低。油酸以ACSL3依赖性方式保护黑色素瘤细胞免于铁死亡,并增加形成转移性肿瘤的能力。与来自皮下肿瘤的黑色素瘤细胞相比,静脉注射后来自淋巴结的黑色素瘤细胞对铁死亡更有抵抗力,并能形成更多转移。因此暴露于淋巴可保护黑色素瘤细胞免于铁死亡,并提高它们在血液转移过程中存活的能力。

 

 

小鹿推荐

 

癌细胞转移是恶性肿瘤重要特征之一,相关研究也比较深入。很多研究表明,淋巴系统促进癌细胞的迁移和存活。为研究癌细胞(包括黑色素瘤细胞)先通过淋巴系统局部转移,再通过血液全身转移的机理,作者进行多项实验,并利用代谢组学技术取得重大进展:即淋巴ApoB+囊泡中的油酸可通过降低氧化应激保护黑色素瘤细胞免于铁死亡,从而提高癌细胞在血液转移存活率,以形成更多转移。其研究成果为肿瘤发生机制与治疗提供重要依据。

 

参考文献:

 

[1]Khaleghi M,Khorrami S,Ravan H.2019. Identification of Bacillus thuringiensis bacterial strain isolated from the mine soil as a robust agent in the biosynthesis of silver nanoparticles with strong antibacterial and anti-biofilm activities.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology18:101047.doi:10.1016/j.bcab.2019.101047.

[2]Liao S,Zhang Y,Pan X,Zhu F,Jiang C,et al. 2019.Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.Int J Nanomedicine 14:1469-1487.doi:10.2147/IJN.S191340.

[3]Zhang Y,Pan X,Liao S,et al.Quantitative Proteomics Reveals the Mechanism of Silver Nanoparticles against Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Biofilms[J].Journal of Proteome Research,2020 Aug 7;19(8):3109-3122..

 

猜你还想看

 

不容小觑!Cell:首次实现蛋白质/RNA整合,“定量”人类蛋白质图谱

“细菌杀手?”中南大学基础医学院陈利玉团队揭示银纳米颗粒抗铜绿假单胞菌生物膜的机制

新视角cell | 液体活检新突破! 最大规模细胞外囊泡和颗粒蛋白质组学分析

Nature | 为抗生素“续航”,质谱技术与结构生物学结合解释脂多糖-蛋白质复合物结构与作用

 

END