10x单细胞空间转录组测序

 
 
10x单细胞空间转录组测序
 
空间转录组是一种用于从空间层面上解析RNA-seq数据的技术,从而解析单个组织切片中的所有mRNA。
空间条形码逆转录oligo(dT)引物在显微镜载玻片表面的有序附着,使得在mRNA样品处理和后续测序过程中位置信息的编码和获取成为可能。
 
单细胞RNA测序或组织样本RNA测序,均无法为研究人员提供精确的空间信息。
通过空间转录组技术可获取组织中具体位置的转录信息,为研究和诊断提供有效数据支撑。
 
 
 
 
应用方向
 
10x Genomics空间转录组技术可以应用于肿瘤、免疫、发育、神经和病理等研究方向。
 
 
 
 
 
技术优势
 
• 广泛的样本适用性:适合大多数组织类型;
• 简单的操作流程:一个工作日内可完成从组织切片到文库的工作流程;
• 较高的分辨率:每个捕获区域包含 5000 个 spots,每个 spots 捕获平均 1-10 个细胞;
• 易于与组织学分析的实验室方法和工具集成。
 
 
 
 
实验原理
 
10x  Genomics空间转录组用于文库构建的每张载玻片上有四个捕获区域,每个捕获区域的大小为6.5x6.5mm,包含5000个被条形码标记的点(barcoded spots),每个点的直径为55 μm,点和点之间中心的距离为100 μm,并且每个点都有一个唯一的barcode序列。
组织切片的细胞中会释放出mRNA,迁移到每个spot的mRNA会被标记上相应的barcode序列,然后进行文库构建并进行测序。
最后,根据数据的条形码信息对数据进行分析,以确定哪些数据来自哪个位置,从而实现空间基因表达的可视化。
 
 
 
 
 
实验流程
 
10X Visium的实验主要分为两部分:组织学板块和组学板块。组织学板块包括样品的包埋、切片、固定、染色及成像,记录切片的形态学信息;组学板块包括cDNA的合成、扩增、接头连接和测序,记录切片的转录本信息和空间位置信息 。具体实验流程如下:
A、切片制备和优化:取新鲜组织、冷冻、切片,并进行HE染色成像,优化确定切片是否覆盖靶向区域。
B、切片固定和透化:将组织切片放置在含有与RNA结合捕获探针的载玻片上,并进行固定和透化,使细胞中的 mRNA 得到释放,并结合到相应的捕获探针上,从而获取基因表达信息。
C、逆转和文库构建:以捕获的 RNA 为模板,进行 cDNA 合成,和测序文库制备。
D、高通量上机测序:对制备好的测序文库,进行二代高通量短读长测序。
E、数据可视化分析:结合HE结果,确定哪些基因有表达,表达量高低,以及这些基因的空间位置信息
 
 
 
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