10x单细胞转录组测序

 
 
10x单细胞转录组测序
 
技术优势
 
(1)通量高:一次可以同时测8个样本,每个样本最多可以检测到上万个细胞;
(2)周期短:7分钟内完成上万个细胞封装,一天之内完成细胞悬液制备、单细胞捕获、扩增以及建库;
(3)“真”单细胞测序:真正意义上实现单细胞测序;
(4)捕获效率高:细胞捕获效率高达65 %;
(5)应用范围广:动物细胞和植物细胞均可以进行单细胞测序,已广泛应用于肿瘤细胞异质性、免疫细胞群体检测和胚胎发育研究等。
 
 
 
 
技术原理
 
10× Genomics的Chromium系统利用8通道的微流体“双十字”交叉系统
将含barcode的凝胶珠(Gel Beads)、细胞和酶的混合物、油三者混合,形成GEMs(油包水的微体系)
GEMs形成后,细胞裂解,凝胶珠自动溶解释放大量barcode序列
随后mRNA逆转录产生带有10× barcode和UMI信息的cDNA,构建标准测序文库
下图展示Chromium Single Cell 3’ Solution 中mRNA逆转录产生带有10× barcode和UMI信息的cDNA过程
 
 
反转录成cDNA之后,酶切打断,加上测序接头,构建二代测序文库。如下图所示。
 
 
 
 
 
建库流程
 
 
(1)凝胶珠进入第一个进样口与细胞悬液和酶等混合,通过第二个进样口时被油滴包裹,形成GEMs,随后细胞裂解,凝胶珠溶解,进行逆转录;
(2)油滴破裂,收集cDNA产物,进行cDNA扩增;
(3)构建测序文库进行测序。
 
 
 
 
样本要求
 
(1)样品总量:制备成细胞悬浮液,一个样本的细胞起始量需大于1×10 5个;
(2)样品浓度:最终上样前细胞浓度在700 - 1,200 cells / μL;
(3)细胞活性:活细胞数目在85 %以上;
(4)细胞大小:直径小于40 μm;
(5)细胞培养基及缓冲液不能含有Ca 2+和Mg 2+等影响酶活性的物质;
(6)组织需解离成单细胞悬液,植物细胞需制成原生质体。
 
 
 
 
预实验结果判断
 
图1
 
图2
 
图3
 
图1中死细胞太多,达不到上机要求,图2中杂质太多,建议通过细胞筛或者离心去杂质处理,图3的细胞是达到上机要求的。
 
 
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