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13种单细胞RNA扩增测序方法的比较

单细胞RNA测序(scRNA-seq)是绘制单个细胞分子特性的主要技术。目前高通量单细胞测序一次可以研究数千甚至上万个细胞,从而使科研人员可以对样本组成进行深入的研究。
 
然而,各种scRNA-seq技术之间存在着重要的差异,目前并不清楚哪种方法最适合绘制组织、器官和生物体的细胞图谱。Nature biotechnology最近发表的一篇文章通过多个实验室合作,对同样的细胞样本进行了13种方法的单细胞测序,系统地评估了这几种技术在全面描述细胞类型和状态方面的能力。

实验设计

一 . 样本设计原则

      1. 不同频率的高度异质性的细胞类型

      2. 基因表达有细微差异的密切相关亚群

      3. 具有可追踪标记的确定的细胞组成

      4. 来自不同物种的细胞

 
二 . 实验设计及流程
人类外周血单个核细胞(PBMC)和小鼠结肠样本,另外选取狗作为对照,共3个物种(人,小鼠和狗)的5个细胞系,按照一定比例混合后分为13份用不同方案进行实验。

      1. PBMC(60%,人)

      2. 结肠(30%,小鼠)

      3. HEK293T(6%,RFP标记的人细胞系) 

      4. NIH3T3(3%,绿色荧光蛋白标记的小鼠细胞)

      5. MDCK(1%,TurboFP650标记狗细胞)(见图1)

 
* 每份样本25000个细胞,分别分发给各个实验室开展工作
 
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图1 | 实验流程
 
三 . 扩增方法汇总
文中的13个实验方案,涉及了表1中的11种实验技术
 
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实验结果
1. 不同检测方法检测到的细胞占比及基因元件不同
从图1可知,各种方法检测到大多数细胞为人(63-95%)或小鼠(4-34%;图1)。但是不同方法检测的不同物种细胞占比不同,其中10X的两种方法(针对细胞核和细胞质)其人细胞占比明显低于其它几种方法。而gmcSCRB-seq方法和ICELL8两种方法检测到人的细胞占比高于其它方法。狗的MDCK细胞掺入量较低,其他方法的检出占比在1-9%之间,但是gmcSCRB-seq方案中未检出该细胞类型。尽管大部分的scRNA-seq方法都会检测到内含子成分,但是由于细胞核中存在未加工的RNA,10X的细胞核测序所检测到的内含子序列是最多的(图1)。
 
2. 检测基因数
对人类HEK293T细胞、单核细胞和B细胞(图2)测序数据结果分析显示不同方案检测到的基因数量存在巨大差异,其中Quarts-seq2对三种细胞类型的基因检出都是最高的,在HEK293T细胞中,CEL-seq2和Smart-seq2以及Chromium显示了较高的基因检出数,另外两种细胞中CEL-seq2的表现仅次于Quarts-seq2,但是优于其它方法。
 
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图2 | 三种细胞的检出基因数
 
3. 不同检测方法的数据比较
对HEK293T细胞,单核细胞和B细胞的测序数据,选取高度变化的基因进行主成分变化分析(图3a)显示,不同方法对单个细胞内的基因检出数量是它们之间的主要差异(图3b)。然而,PC分析也显示了来自不同方法的细胞数据结果会相互混合,而不会各自聚类,这表明不同方法所得的数据具有保守性,同时,来自snRNA(细胞核)的数据并没有表现出明显的异常值,表明细胞质和细胞核之间转录组数据一致性较高。分析结果还显示,当细胞数量较多时,不同方法之间的相关性较高,而细胞数量较少时,则方法的相关性较差(图3c)。Chromium snRNA-seq方法显示了一个显著的异常值,可能是由于未成熟转录物的导致相关性下降。虽然标记基因是所有技术都能够检测到的,但是检测的结果却有很大不同。Quartz-seq2和Smart-seq2对所有细胞类型的标记基因都能检测出其较高水平的表达,显示了这两种方法具有更高的细胞类型识别能力。
 
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图3 | 不同检测方法的数据比较
 
4. 聚类分析结果
对数据进行聚类分析的作图,然后计算聚类精确度和ASW来判断不同方法检测复杂样本的异质性的能力(图4a,4b)。结果发现不同的方法具有不同的聚类精确度和ASW。单核细胞的分析结果表明,精确的聚类方案能够区分CD14和FCGR3A+等细胞亚群,但是低ASW的方案不能区分这两种细胞,同样的,有些方法能区分CD8和NK细胞,但是有些方法不行。
 
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图4 | 聚类分析

实验结论
对几种方法进行基因检测、转录特征表达的总体水平、细胞簇的准确性、分类概率、数据整合后的细胞簇准确性以及可混合性等六个关键指标的综合评估发现:其中效果最好的是Quartz-seq2,其次是10XChromium,Smart-seq2排在第三位。要注意的是,在本文所比较的所有方法中,只有 Smart-seq2是对全长cDNA进行研究的,因此,如果对基因表达量进行研究可以采用其它方法,而如果需要研究单细胞全长cDNA转录本,则只有Smart-seq2可用。
 
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图5 | 不同方法的各项指标排序

参考文献
Mereu, E., Lafzi, A., Moutinho, C. et al. Benchmarking single-cell RNA-sequencing protocols for cell atlas projects. Nat Biotechnol (2020). https://doi.org/10.1038/s41587-020-0469-4

 

 

 

 

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