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Nat Genet | 全外显子组测序助力心脏病新功能基因的发掘

- 基本信息 -

文章题目:ADAMTS19 的缺失导致渐进性非综合征心脏瓣膜病

Nat Genet | 全外显子组测序助力心脏病新功能基因的发掘

 

发表期刊:Nature Genetics

发表时间:2020.1

影响因子:25.5

- 文章摘要 -

心脏瓣膜疾病在普通人群中观察到的比例约为2%。虽然最初观察到的通常是局部的(如主动脉或二尖瓣膜),但在其他瓣膜中经常能观察到疾病表征,而且病人通常需要手术治疗。尽管心脏瓣膜疾病发病率很高,但迄今为止仅有少数基因被确定为该病的唯1发病原因。在此,我们确定了两个血亲家庭,每个家庭中都有两个受影响的家庭成员,他们很早就出现了渐进性心脏瓣膜疾病。

全外显子组测序显示,在所有四个受影响的个体中都存在ADAMTS19 基因同源的、截断的无义等位基因。Adamts19 基因同源敲除的小鼠表现为主动脉瓣功能障碍,重现了人类表型的各个方面。利用lacZ报告基因和单细胞RNA-seq进行表达分析,表明Adamts19 是瓣膜间质细胞的一个新的marker。在瓣膜间质细胞基因调控网络的推论中,Adamts19 被定位在一个高度辨识性的网络,这个网络由Wnt信号通路下游的转录因子lymphoid enhancer-binding factor 1驱动。在Adamts19 敲除小鼠血流动力学扰动中上调心内膜的Krüppel-like factor 2,表明完整的瓣膜成熟和维持需要Wnt-Adamts10-Klf2轴的紧密平衡。
 

- 背景简介 -

瓣膜性心脏病可影响心脏瓣膜中的任何一个,并常与综合征紊乱有关。已有研究表明心脏瓣膜病(HVD)有复杂的遗传结构。尽管不同类型的HVD如二尖瓣脱垂、二尖瓣主动脉瓣(BAV)发生率较高,但只有少数病例在非综合征背景下存在潜在的单基因病因。
 

- 主要结果 -

1.利用全外显子组捕获测序分析了两个带有无综合症的早期发病HVD隐性遗传模式的不相关的血缘家庭,在4个受影响的个体的ADAMTS19 基因中发现了纯合的罕见功能缺失(LOF)等位基因。

家族1的父母(I-1和I-2)是表亲(图1a),他们都携带ADAMTS19 罕见的拷贝数变异重叠外显子1 - 8 (图1c)。这个家庭中有两个孩子是纯合缺失型,在生命早期被诊断为HVD。在第2家庭中,作为表亲的父母在ADAMTS19 中携带一种罕见的截断性无意义突变(图1 b, d)。他们的两个孩子属于纯合突变,在生命早期被诊断为HVD,并逐渐恶化,而他们的杂合子兄弟姐妹和父母均未表现出该病的症状(图1e,f)。对两个家系的ADAMTS19 位点进行隐性连锁分析,由于受影响的个体数量有限,没有达到显著差异。尽管没有显著连锁,ADAMTS19 代表所有受影响个体表现为纯合、罕见的功能缺失等位基因的唯1基因,使其成为观察到的HVD的候选基因。与其他ADAMTS关联疾病相比,没有综合症是识别受HVD影响的病人的特征,表明ADAMTS19 的功能缺失导致了人类孤立的、无综合征的、渐进性的HVD。

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图1 | 人类家族中ADAMTS19 纯合缺失导致渐进性HVD

 

2.创制了纯合ADAMTS19 基因敲除的小鼠(Adamts19 KO/KO)。

超声心动图分析显示,三个月时,38%的Adamts19 KO/KO小鼠出现渐进性主动脉瓣疾病,表现为反流和/或主动脉瓣狭窄)(图2)。

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图2 | Adamts19 KO/KO 纯合小鼠患主动脉瓣疾病

 

3.对Adamts19 KO/KO纯合敲除小鼠进行了组织学观察。

发现主动脉瓣密度更大,小叶中有局部的黑色素细胞聚集。纯合敲除的小鼠失能主动脉瓣与对照组相比,瓣叶内的细胞外基质(ECM)组织紊乱。瓣叶铰链区主动脉瓣明显增厚。主动脉瓣叶环部分融合显示覆盖中缝的铰链处胶原沉积增多(图3)。

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图3 | Adamts19 KO/KO小鼠的主动脉瓣在9个月时变厚,ECM紊乱

 

4.利用电镜观察野生型小鼠和Adamts19 KO/KO小鼠的主动脉瓣ECM的超微结构。

发现野生型小鼠切片中可见的三层结构在6月龄突变小鼠的老化、患病的主动脉瓣中仍有保留。但突变小鼠的瓣膜更厚,有更多细胞碎片,小束胶原纤维和丰富的蛋白多糖,尤其是在小叶尖端。在9月龄Adamts19 KO/KO小鼠中,没有观察到任何与瓣膜疾病相关的钙化,表明在该模型中驱动疾病的机制与钙化的主动脉瓣膜疾病不同。利用免疫组化(IHC)测试了几个HVD候选ECM蛋白,没有发现显著差异表型。而且,通过主动脉瓣血流形态与病理分析,揭示Adamts19 KO/KO小鼠在功能性的融合BAV-like表型方面与人类相似。

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图4 | 野生型小鼠和Adamts19 KO/KO小鼠的主动脉瓣ECM的超微结构分析
 

5.对瓣膜发育和成熟过程中Adamts19 的时空表达模式进行了分析。

在Adamts19 敲除小鼠中,lacZ首先在胚胎发育(E)10.5天左右的骨头和软骨区域表达。在E12.5左右,首先观察到心脏心房、心室小梁状心肌和心垫区弱弥漫性lacZ染色。在E14.5左右,所有四个瓣膜中均可见到lacZ的强烈局部表达,并且在成年之前都可以检测到(图5)。

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图5 | 在瓣膜重塑和延伸过程中,所有四个瓣膜都表达了Adamts19


6.利用Drop-seq技术对E14.5 野生型(WT)和Adamts19 KO/KO小鼠心脏进行单细胞RNA测序。

通过scRNA-seq,发现已知的细胞类型的标记基因在WT和Adamts19 KO/KO细胞中保存,并且证实Adamts19 KO/KO细胞中不存在有功能的信使RNA,Adamts19 和lacZ在VICs、小梁和心房肌细胞中特异性表达。

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图6 | 胚胎发育14.5天的小鼠心脏单细胞测序分析。

 

- 研究结论 -

研究者用有力的证据表明,ADMATS19 的纯合LOF在人类和小鼠中导致非综合征的进行性HVD。小鼠中Adamts19 的时空表达模式、Adamts19 小鼠敲除模型和scRNA-seq数据表明,在Wnt信号的控制下VICs对内皮机制调控的关键反馈,这与之前的研究报道一致。基于此,研究者假设Adamts19的缺失扰乱了主动脉瓣内皮细胞的剪切应激(shear stress)信号传导,导致转录因子Klf2的过度表达。随着时间的推移,这种机制转导通路的缺陷导致细胞增多和瓣膜中的蛋白多糖沉积、ECM紊乱和HVD。该数据为进一步研究ADAMTS19 在VICs中维持ECM完整性和间充质-内皮信号正确平衡的具体作用提供了基础,二者都是HVD的致病源和潜在治疗靶点。
 

参考文献

Wünnemann F et al. Loss of ADAMTS19 causes progressive non-syndromic heart valve disease. Nature Genetics 2020 Jan;52(1):40-47
 

欧易-全外显子组测序
 

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本文系欧易生物原创

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