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Nature | 为抗生素“续航”,质谱检测与结构生物学结合解释脂多糖-蛋白质复合物结构与作用

 

脂多糖(Lipopolysaccharide, LPS)存在于革兰氏阴性菌的外膜(outer membrane),起到细胞屏障的作用。LPS在临床上可以引起败血性休克(septic shock)进而导致死亡,LPS的脂A内核(Lipid A core)是多粘菌素抗生素(polymyxin antibiotics)的靶点。尽管多粘菌素在临床上均有重要性,并且已经有多种耐药菌株出现,但是目前对LPS生物合成的调节机制仍然不清楚。

 

近日,来自Genentech公司的科学家们在Nature发表了论文,对存在革兰氏阴性菌内膜(inner membrane)上的蛋白质PbgA进行了详细表征,并指出其可以通过降低LPS的含量以及外膜的完整性来降低大肠杆菌(Escherichia coli)的毒性。该课题组首先通过结构生物学和代谢组学研究鉴定出革兰氏阴性菌内膜上存在一个脂A的结合区域(lipid A-binding motif),随后发现PbgA衍生多肽可以选择性的与LPS结合,进而抑制革兰氏阴性菌的生长(其中包括对多粘菌素具有抗药性的菌株)。通过进一步的蛋白质组学代谢组学、遗传学和药理学实验,作者建立了一个PbgA调控LPS的模型。这是首次报道PbgA具有调控LPS的作用,为后续新抗生素的发现提供的新的机会。

 
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PbgA是一种内膜蛋白质,推测其功能是携带心磷脂(cardiolipin)并将其从细胞内膜运输到细胞外膜。然而最近的结构研究未能证实该功能。作者选择研究PbgA,是因为PbgA涉及到沙门氏菌(Salmonella,属于大肠杆菌)的发病机理,其在维持外膜中的作用依然未知。

 

作者首先对一株PbgA缺失的菌株(Δ pgbA)进行了研究,相关指标(包括回收的菌落形成单位(CFU),对血清、利福平的敏感性、细胞形态等)显示,与野生菌株相比,PbgA缺失的菌株表现出细胞形状的丧失和膜破裂;总脂质A(total lipid A)减少等,这些均显示脂质稳态的丧失,证实了PbgA在维持外膜功能中的重要性。有意思的是,一株PgbA缺失的菌株,在缺乏心磷脂的环境下,并没有表现出对利福平的敏感性,促使作者进一步的研究PgbA在心磷脂缺乏环境下的发病机理。

 

为了深入研究PgbA的功能,作者对纯化后的PgbA利用X射线衍射进行分析。结果显示其周质结构域(periplasmic domain)锚定在跨膜结构域(transmembrane domain,TMD)上,在内膜上方形成了一个60Å的突出区域。通常能转运心磷脂的区域大约在200Å左右,因此PgbA在结构上不具备转运心磷脂的条件;此外,将PgbA的结构与EptA linker(已确定具有心磷脂转运功能)相比,两者的结构并不完全相似。(图1)。

 

 

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图1 | PbgA结构特征

 

为了证实PgbA无法转运心磷脂以及PgbA哪些化合物结合,作者采用了结构模拟计算和基于质谱的代谢组学的方法。结构模拟实验中,加入心磷脂后的模型无法形成稳定的电子密度;代谢组学实验则利用质谱对纯化后的PgbA进行分析,并没有鉴定到心磷脂。但是在代谢数据中,发现了多种脂质A(lipid A)的存在(图2)。随后作者利用脂质A与PbgA进行结构模拟,发现在脂质A存在的情况下,PgbA的结构模型趋向合理,由此推测PgbA可以与脂质A结合,进而与LPS分子结合。进一步的实验证明当PgbA与脂质A的结合区域发生突变时,细胞外膜功能会丧失,表明了LPS-PbgA结合是维持外膜稳态的重要因素。

 

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图2 | LPS共纯化物中鉴定出脂质A

 

鉴于PbgA可以与LPS结合,作者推测利用PbgA结合区域的保守序列所衍生出的多肽,在体外也可以与LPS结合。实验显示一种衍生肽(LABWT+ )对LPS具有更强的亲和力,并且对磷脂依然保持有选择性。由于多粘菌类抗生素是通过靶向脂质A来抑制革兰氏阴性菌,作者提出可以优化衍生肽的序列,从而使其具有广谱活性,有利于后续药理学领域的开发。

 

为了揭示PbgA与LPS结合的生理作用,作用使用免疫共沉淀-质谱技术对内源性大肠杆菌的PbgA进行了蛋白质组分析,结果共鉴定出2个细胞被膜(cell envelope)蛋白:PlsY和LapB。在完整的大肠杆菌中,这两个蛋白质与PbgA相互作用,其中PlsY参与了磷脂合成,LapB参与LPS的生物合成。与PbgA的功能类似,LapB的存在对外膜的功能也是必须的,LapB通过与一种蛋白酶FtSH (FtSH protease) 相互作用来 促进LpxC(一种在脂质A生物合成过程中起关键性作用的蛋白酶)的降解;而免疫共沉淀数据发现PbgA与FtSH没有相互作用,但实验表明在PbgA耗尽后未检测到LpxC;而当PbgA过表达时LpxC水平则升高。结合PbgA独特的空间位置,作者推测PbgA通过直接感知LPS,进而通过LapB-LpxC机制来维持外膜的稳态。

 

作者最后指出,一系列的实验和结构模拟提示PbgA的结构与已知的转运蛋白结构不相似,并且心磷脂无法与PbgA共纯化,可以推断心磷脂无法之前推测的那样与PbgA结合。而通过代谢组学发现的脂质A,则为PbgA的选择性脂质识别提供了一个新的范例。利用这种选择性识别衍生出的LPS结合肽,显示出对病理性的大肠杆菌等革兰氏阴性菌的杀伤能力,为相关药理学研究提供了新的思路。

 

小鹿贴士

 

作者首先通过结构生物学的模型推测PbgA无法与心磷脂结合,进而通过基于质谱的代谢组学技术筛选出与PbgA结合的化合物(脂质A);

通过免疫共沉淀的蛋白质组学方法鉴定出与PbgA相互作用的蛋白质,进而揭示了PbgA与LPS复合物的作用机理。

质谱技术由于其通用性,可以进行非靶向性的分析,例如文本中利用代谢组学,发现PbgA的共纯化中不含有心磷脂,含有脂质A。也可以结合免疫共沉淀结技术进行靶向分析例如文本利用对应的抗体,鉴定出于PbgA结合的蛋白质。

在结构生物学研究中,质谱技术可以与电镜技术、理论模拟相结合,提供更全面的解决方案。

 

参考文献:

 

1.T. Clairfeuille et al., Structure of the essential inner membrane lipopolysaccharide–PbgA complex. Nature 584, 479-483 (2020).
 

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文章来源于鹿明生物

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