组学干货

中南大学陈利玉团队运用TMT标记定量蛋白组学揭示银纳米颗粒抗铜绿假单胞菌生物膜的机制

前言

 

2020年6月中南大学基础医学院陈利玉课题组在Journal of Proteome Research发表的题为 “Quantitative proteomics reveals the mechanism of silver nanoparticles against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa biofilm”的研究成果,通过TMT标记定量蛋白质组学研究方法,发现银纳米颗粒通过抑制铜绿假单胞菌的粘附和运动,刺激强烈的氧化应激反应,破坏铁稳态等多种方式抑制了铜绿假单胞菌生物膜,为阐明银纳米颗粒对抗生物膜的机理提供了新的见解,从而为其临床应用提供了理论基础。
 

 

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中文标题:定量蛋白质组学揭示银纳米颗粒抗耐药绿脓杆菌生物膜的机制

研究对象:铜绿假单胞菌(绿脓杆菌)

发表期刊:Journal of Proteome Research

影响因子:4.074

运用生物技术:TMT定量蛋白质组学

 

研究背景

 

铜绿假单胞菌是一种常见的机会病原体,可导致严重的眼、耳、泌尿道和呼吸道感染。由于抗生素的滥用,该菌的耐药率逐年提高。其抗生素抗性的机制涉及许多方面,生物膜形成是其中重要的机制。细菌生物被膜是指细菌粘附于接触表面,分泌多糖基质、纤维蛋白、脂质蛋白等物质,将其自身包绕其中而形成的大量细菌聚集膜样物,其是细菌为适应自然环境有利于生存的一种生命现象。生物膜的抗生素抗性有着多方面的机制,包括细胞外聚合物(EPS)阻碍抗生素的渗透,生物膜深处细菌缺乏养分和氧气导致代谢水平低等机制。因此,迫切需要开发新的抗生物膜药物。

 

银纳米颗粒(AgNPs)是一种新型的广谱抗菌剂,且其对哺乳动物细胞显示出低细胞毒性。近年来,已经发现AgNPs不仅影响浮游细菌,而且对细菌生物膜也有影响。生物膜变性测试表明,超过90%的细菌生物膜被AgNPs破坏[1]。先前研究结果表明,AgNPs可以诱导抗耐多药铜绿假单胞菌的氧化应激[2]。然而,它仅验证了AgNPs对耐多药铜绿假单胞菌浮游阶段的影响,仍需要探索AgNPs对耐多药铜绿假单胞菌生物膜的作用机理。

 

研究思路

 

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研究结果

 

1.AgNPs抑制生物膜形成

 

作者用结晶紫法评估铜绿假单胞菌的生物膜生物量。结果表明,铜绿假单胞菌在静态培养4小时后开始形成生物膜,并且生物膜生物量随培养时间的延长而显着增加(图1A)。当暴露于不同浓度的AgNPs时,铜绿假单胞菌生物膜的生物量以浓度依赖性的方式降低(图1B)。

 

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图1 |  AgNPs阻止铜绿假单胞菌生物膜形成

 

2.AgNPs破坏已存在的生物膜

 

AgNPs以浓度依赖性方式破坏了预先形成的生物膜(图2A)。当用低浓度的AgNPs处理1小时后,生物膜的生物量开始显著减少,但是经过6小时的AgNPs处理后,生物膜恢复了生长(图2B)。而当暴露于高浓度AgNPs1小时后,生物膜生物量显著减少,处理6小时后生物膜生物量仍然处于较低水平(图2B)。结果表明,AgNPs对生物膜的破坏作用与其浓度呈正相关。

 

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图2 | AgNPs引起铜绿假单胞菌生物膜分散

 

3.AgNPs破坏了生物膜结构

 

将预先形成的铜绿假单胞菌生物膜暴露于AgNPs 24小时,并且通过扫描电镜观察生物膜结构和生物膜生物量。对照组的细菌细胞膜是完整的,生物膜中的细菌显示紧凑的排列且表面光滑(图3A和B)。当铜绿假单胞菌暴露于AgNPs后,生物膜从盖玻片表面脱落,且通常伴随着生物量减少和结构变形或破裂。此外,细菌因其内含物释放而变得肿胀或萎缩(图3C和D)。

 

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图3 | 铜绿假单胞菌生物膜的扫描电镜图像

 

(A,B)对照组生物膜;

(C,D)AgNPs处理过的生物膜;

 

4. 蛋白质组学揭示AgNPs破坏生物膜的机制

 

为了进一步了解AgNPs对抗生物膜的潜在机制,作者通过TMT蛋白质组学分析了AgNPs对生物膜蛋白表达的影响(图4A)。结果发现AgNPs处理1小时后,铜绿假单胞菌中有317种蛋白质上调,324种蛋白质下调(图4B)。

 

GO富集分析表明上调蛋白富集在“抗氧化活性”、转运蛋白活性”等条目中(图4C),而下调蛋白富集在“电子载体活性”,“核糖体的结构成分”等条目中。KEGG通路富集分析表明由AgNPs诱导的差异蛋白集中在“氧化磷酸化”,“氮代谢”,“细菌趋化性”,“鞭毛装配”和“核糖体”等通路(图4D)。
 

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图4 | AgNPs处理的铜绿假单胞菌生物膜的TMT蛋白质组学结果分析

 

4.1.AgNPs影响生物膜细菌的粘附和运动

 

TMT蛋白质组学结果表明,多数鞭毛蛋白、菌毛蛋白和生物膜的趋化性相关蛋白在AgNPs处理的生物膜中下调(图5A),从而抑制细菌的粘附和运动。与对照组相比,低浓度的AgNPs显着抑制了铜绿假单胞菌的游动(swimming)、涌动(swarming) 和颤动(twitching motility)(图5B, C, D)。

 

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图5 | AgNPs对铜绿假单胞菌黏附和运动的影响

 

4.2.AgNPs诱导强烈的氧化应激反应

 

根据以往研究结果,作者推测氧化应激也可能是AgNPs对抗生物膜的机制之一。实验结果表明暴露于AgNPs 1小时后,铜绿假单胞菌生物膜的ROS荧光强度会随着AgNPs浓度的增加而显著增加(图6A)。但是添加GSH或AsA后,ROS的相对荧光强度明显降低,生物膜生物量增加(图6C)。这些结果表明AgNPs通过诱导氧化应激发挥抗生物膜的作用。TMT蛋白质组学分析表明,AgNPs刺激铜绿假单胞菌生物膜中的氧化应激,其中过氧化氢酶(KatA,KatB和KatE),超氧化物歧化酶(SodA),烷基氢过氧化物还原酶(PA0269,PA0848和PA0565)和有机过氧化氢抗性蛋白(Ohr)的水平明显较高。(图6D)。此外,经AgNPs处理的生物膜中,参与核酸复制、转录相关的蛋白质(DeaD,RhlE,Rep,RapA和RpoZ)和DNA修复的蛋白质丰度较低(图6D)。qRT-PCR验证katA,katB,ohr的结果与蛋白质组学结果一致(图6E)。
 

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图6 | AgNPs诱导铜绿假单胞菌生物膜中的氧化应激

 

4.3.AgNPs破坏铁稳态

 

TMT蛋白质组学结果表明AgNPs处理后铁离子摄取相关蛋白丰度升高,而铁存储蛋白和铁硫簇合成蛋白显著减少(图7A),这表明铜绿假单胞菌生物膜中铁稳态的失衡可能增加ROS的产生并导致氧化损伤。
 

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图7 | AgNPs对铜绿假单胞菌生物膜中铁代谢相关蛋白的影响

 

4.4.AgNPs影响有氧和无氧呼吸

 

随着生物膜的发展,生物膜的内部变得高度缺氧。而且,ROS的产生消耗大量的氧气,这进一步降低了细菌局部环境中的氧气压力。在五种已知的铜绿假单胞菌末端氧化酶中,细胞色素cbb3型氧化酶因其在微需氧条件下对铜绿假单胞菌生存的关键作用而被广泛研究。TMT蛋白质组学发现AgNPs处理后,CcoN1,CcoN2和CcoP2的表达下降(图8A)。此外,铜绿假单胞菌能够使用硝酸盐作为末端电子受体进行无氧呼吸,而蛋白质组学结果发现硝酸盐还原酶(NAR)和亚硝酸盐还原酶(NIR)均因AgNPs处理而降低(图8A)。测量NIR活性实验表明表明AgNPs处理的生物膜的NIR活性显著低于对照组(图8B)。这些结果证实AgNPs可以通过抑制铜绿假单胞菌生物膜的需氧和厌氧呼吸而发挥抗生物膜作用。

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图8 | AgNPs对铜绿假单胞菌生物膜有氧和无氧呼吸的抑制作用

 

4.5.AgNPs影响群体感应信号

 

群体感应(quorum sensing)可以调节细菌的表型变化并协调行为反应,例如产生毒力因子、运动性和生物膜形成。因此,作者评估了AgNPs对群体感应系统的影响。(anthranilic acid)是PQS信号分子的生物合成前体。蛋白质组学结果表明,AgNPs处理后参与降解的蛋白质丰度升高。此外AgNPs显著降低了花青素(pyocyanin),鼠李糖脂(rhamnolipid)和弹性蛋白酶(elastase)的产生(图9)。

 
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图9 | AgNPs对铜绿假单胞菌生物膜中群体感应信号和毒力因子表达的影响

 

研究结论

 

文章结果表明AgNPs可以有效抑制铜绿假单胞菌生物膜的形成,并对预先形成的生物膜具有分散作用(dispersing effect)。蛋白质组学分析表明,AgNPs可能通过干扰多种生理过程来对抗铜绿假单胞菌生物膜。暴露于AgNPs可能会干扰生物膜中细菌的铁稳态继而导致ROS产生。过量的ROS会引起脂质过氧化,DNA和核糖体的损伤以及大分子合成的减少,从而导致细菌死亡。ROS的产生也消耗大量的氧气,这降低了生物膜局部环境中的氧气水平,并加剧了低氧应激反应。此外,AgNPs处理可能会抑制有氧和厌氧呼吸酶的功能,结果,细菌将无法适应缺氧应激而死亡。另外,ROS的产生可能影响群体感应系统并抑制毒性因子的表达。总之,AgNPs可以通过细菌的代谢途径改变生物膜的结构和属性,从而最终减轻或消灭生物膜中的细菌(图10)。

 

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图10 | AgNPs对铜绿假单胞菌生物膜的作用机理模型

 

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银纳米颗粒作为新型的抗菌剂,可以消灭生物膜并降低细菌的抵抗力,但其抗生物膜的作用机理尚未阐明。本文结合扫描电子显微镜和TMT标记定量蛋白质组学研究了AgNPs抗铜绿假单胞菌的分子机制。作者发现蛋白质组学结果与表型实验结果相互印证,并结合数据分析推测AgNPs对生物膜的作用机制,其数据分析思路值得借鉴和参考。

 

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参考文献:

 

[1]Khaleghi M,Khorrami S,Ravan H.2019. Identification of Bacillus thuringiensis bacterial strain isolated from the mine soil as a robust agent in the biosynthesis of silver nanoparticles with strong antibacterial and anti-biofilm activities.Biocatalysis and Agricultural Biotechnology18:101047.doi:10.1016/j.bcab.2019.101047.

[2]Liao S,Zhang Y,Pan X,Zhu F,Jiang C,et al. 2019.Antibacterial activity and mechanism of silver nanoparticles against multidrug-resistant Pseudomonas aeruginosa.Int J Nanomedicine 14:1469-1487.doi:10.2147/IJN.S191340.

[3]Zhang Y,Pan X,Liao S,et al.Quantitative Proteomics Reveals the Mechanism of Silver Nanoparticles against Multidrug-Resistant Pseudomonas aeruginosa Biofilms[J].Journal of Proteome Research,2020 Aug 7;19(8):3109-3122..

 

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文章来源于鹿明生物

 

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