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前言

2020年6月德国科隆大学Marcus Krüger课题组在Molecular & Cellular Proteomics期刊发表了题为“Proteomics of Galápagos marine iguanas links function of femoral gland proteins to the immune system”的研究成果,通过蛋白质组学研究方法,首次全面描述加拉帕戈斯海鬣蜥股腺分泌物的蛋白质组成,发现了几种与先天免疫系统直接相关的蛋白质,并报道了几种来自股腺的新型抗菌肽,表明股腺是感染的重要屏障。该数据对股腺功能提出了新的见解并对进一步研究蛋白质功能提供了宝贵资源。

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中文标题:加拉帕戈斯海鬣蜥的蛋白质组学研究发现股腺蛋白功能与免疫系统相联系

研究对象:海鬣蜥

发表期刊:Molecular & Cellular Proteomics

影响因子:4.87

运用生物技术:转录组学,非标定量蛋白质组学

研究背景

海鬣蜥(Amblyrhynchus cristatus)是加拉帕戈斯群岛的特有物种。在繁殖季节,它是大多数雄性中少有的通过保卫资源较少的领地,来吸引雌性的鳞状物种之一。雄性通过其股腺(femoral glands)释放的特定亲脂性物质吸引雌性。股腺是位于多种蜥蜴和两栖动物后腿内侧的表皮腺体,在非蛇状鳞片(non-ophidian squamates)的化学信号系统中起着核心作用[1]。

另外股腺分泌物还是用于交流的化学信号,如标记区域、雄性质量信号以及物种识别[2]。腺体分泌物是蛋白质(约80%),脂质(约20%)和挥发性分子的混合物。虽然脂质部分的化学组成和化学信号功能已有研究[3],但股腺分泌物中蛋白质的种类和功能仍然是未知的。

研究思路

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图1 | 海鬣蜥的蛋白质组学研究流程图

研究结果

1.海鬣蜥的数据库生成和蛋白质组学分析

作者从刚死去的海鬣蜥中分离了大脑、肌肉、心脏、肺和皮肤组织。此外,从同一岛上的活体动物收集了股腺分泌物,精液和血液(图1)。首先对五种组织和分离的红细胞进行了转录组分析,以生成参考蛋白质数据库。转录组数据共翻译出105,810个蛋白质开放阅读框。蛋白质组学共鉴定到7,513种蛋白质,组织平均鉴定到约4,000种蛋白质,血清样品鉴定到约900种蛋白质(图2B),所有组织中共同鉴定到1,551种蛋白质(图2C)。

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图2 | 海鬣蜥的蛋白质组学数据

(A)人蛋白质组和海鬣蜥蛋白质组蛋白质分子量的分布

(B)组织和分泌物中鉴定出的蛋白质数量

(C)不同组织鉴定蛋白种类Venn图

2.海鬣蜥股腺分泌物蛋白质组包含表皮标记和免疫调节蛋白

作者通过挤压海鬣蜥的股腺来分离股腺分泌物(图3A)。SDS-PAGE凝胶电泳发现,与来自同一动物心脏的蛋白质提取物相比,股腺分泌物的蛋白质质量分布较低(约15-40 kDa)(图3C)。质谱分析鉴定了股腺分泌物中的4,305种蛋白质。与SDS-PAGE结果一致,随着低分子量条带到高分子量条带,蛋白的鉴定数量和总强度是递减的(图3B) 。

随后作者关注了每个凝胶条带中丰度最高的5种蛋白质。例如第一个条带中丰度最高的是分子量为12 kDa的蛋白质(图3D)。该蛋白质有16种特异性肽段,且在所有分析的组织中均可检测到,在股腺中丰度最高(图4A)。此外,在DNA和蛋白质水平上与其他生物的序列比对未显示任何直系同源候选基因或保守的蛋白质结构域。这种蛋白质可能是一种快速进化的孤儿基因的产物,该基因在较短的进化时间内失去了序列相似性。

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图3 | 鉴定海鬣蜥股腺中蛋白质

(A)具有分泌物的股腺

(B)海鬣蜥股腺分泌物和心脏中每个凝胶组分的总强度值

(C)心脏和股腺分泌物的蛋白SDS-PAGE图

(D)股腺分泌物各部分中丰度最高的蛋白质

通过蛋白质的强度对这些股腺分泌的蛋白质进行排名,发现了包括表皮素(EPPK1)和cornifelin在内的表皮特异性蛋白质(图4B)。此外,作者鉴定了许多具有脂质结合和脂质修饰特性的蛋白质,这与分泌物的疏水性质相符。有趣的是,股腺分泌物特异性蛋白质组包含具有人类同系物的蛋白,这些蛋白具有免疫应答或宿主防御特性,如Lysozyme C, Galectin-1, 和Antileukoproteinase(图4B-C)。作者使用GO注释发现68种蛋白注释了“激活先天免疫应答”条目,32种蛋白是“自适应免疫应答”条目。

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图4 | 免疫调节蛋白在股腺分泌物中的表达

(A)实体组织和体液样本中股腺分泌物富集蛋白的iBAQ强度

(B)股腺分泌物中富集蛋白的强度分布

(C)选择的分泌特异性蛋白

3.股腺中具有抗菌活性的肽

接着作者通过海鬣蜥蛋白质组产生了潜在的抗菌肽库,并预测了所得肽的抗菌活性(图5)。共得到8,675个潜在候选物,并选择了其中由13种具有高水溶性和稳定性的蛋白质产生的17种抗菌肽进行下一步研究。

实验结果表明14种肽具有中等抑制活性,而4号肽KKLYISKGCMSKSLC表现出了对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌培养物的强力抗菌作用。

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图5 | 筛选海鬣蜥蛋白质组中的抗菌肽

(A)预测抗菌肽流程

(B)大肠杆菌K12培养物中海鬣蜥肽“Iguana-04”和“Iguana-02”的最小抑制浓度

(C)枯草芽孢杆菌培养物中海鬣蜥肽“Iguana-04”和“Iguana-02”的最小抑制浓度

相关讨论

加拉帕戈斯鬣蜥祖系大约在5- 6百万年前分为陆地和海洋鬣蜥世系。海洋鬣蜥在全世界蜥蜴物种中独树一帜,已经进化出了几种独特的方式来适应海洋环境。本文首次描绘了海鬣蜥的蛋白质组学图谱,与蜥蜴股腺分泌的蛋白质应在化学通讯中发挥作用的总体预期相反,作者发现了海鬣蜥股腺分泌组对微生物和其他潜在病原体具有复杂而丰富的分子屏障。

本文开辟了研究此类蛋白功能和潜在应用的新途径。鉴定到的几种新型蛋白酶抑制剂和C型凝集素蛋白可能为鉴定新型治疗蛋白和蛋白酶诱导的人肺和皮肤疾病炎症反应的抑制剂提供基础。此外,蛋白质组学结果表明股腺可能是新型生物活性抗菌肽的来源。由于许多抗菌肽仅在细菌感染后才表达和加工,因此筛选具有不同健康状况动物的腺体分泌物可能是鉴定候选物的另一种方法,从而开发潜在的新抗生素。

研究结论

通过蛋白质组学技术,作者分析了加拉帕戈斯海鬣蜥股腺分泌物中的蛋白质。在该物种中,股腺分泌物有助于雄性质量信号传递和伴侣识别。尽管本研究没有发现涉及化学通讯的蛋白质和肽的证据,但却鉴定到了几种免疫调节蛋白,这些蛋白具有抗菌功能。研究结果表明股腺蛋白和肽可作为抵抗微生物感染的屏障,并可以防止挥发性物质的快速降解。

小鹿推荐

本文通过蛋白质组学方法首次全面表征加拉帕戈斯海鬣蜥的股腺分泌物的蛋白质组成。使用来自多个器官的样品,通过高通量测序技术和质谱技术鉴定了海鬣蜥蛋白质组,得到7,513种蛋白质。该蛋白质组学数据集是蛋白功能分析的宝贵资源,它证明了股腺分泌物也具有先天免疫系统的功能。通常基于质谱的蛋白质组学需要物种的蛋白质参考库,通过对质谱结果搜库以实现蛋白质定性。对于研究较少没有已知蛋白质数据库的“小物种”,作者以转录组结果建立蛋白质组参考库的做法值得借鉴。

参考文献:

[1] Mayerl, C., Baeckens, S., and Van Damme, R. (2015) Ecolution and role of the follicular epidermal gland system in non-ophidian squamates. Amphibia-Reptilia 36, 185-206.

[2] Imparato, B. A., Antoniazzi, M. M., Rodrigues, M. T., and Jared, C. (2007) Morphology of the femoral glands in the lizard Ameiva ameiva (teiidae) and their possible role in semiochemical dispersion. J Morphol 268, 636-648

[3] Khannoon, E. R., Dollahon, N. R., and Bauer, A. M. (2013) Comparative study of the pheromone-manufacturing femoral glands in two sympatric species of lacertid lizards (Acanthodactylus). Zoolog Sci 30, 110-117

[4] Tellkamp F , Lang F , Alejandro Ibáez Ricoma, et al. Proteomics of Galápagos marine iguanas links function of femoral gland proteins to the immune system[J]. Molecular & Cellular Proteomics, 2020:mcp.RA120.001947.

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文章来源于鹿明生物

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