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项目文章 | 精准靶向代谢组学助力首都师范大学证明拟南芥种子萌发机制

前言
 

2019年9月,欧易/鹿明生物合作客户首都师范大学鞠传丽教授在Journal of Experimental Botany(IF:5.908)杂志在线发表了题为“Methionine Synthase 1 Provides Methionine for Activating AtGLR3.5 Ca2+ Channel and Regulating Germination in Arabidopsis”的研究论文,通过GC-MS靶向代谢组学证明了L-Met通过上调AtGLR3.5介导的细胞溶质Ca2+信号促进拟南芥种子萌发。
 

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中文标题:甲硫氨酸合酶1为激活AtGLR3.5Ca2+通道和调节拟南芥种子萌发提供甲硫氨酸

研究对象:拟南芥

发表期刊:Journal of Experimental Botany

影响因子:5.908

合作单位:首都师范大学

发表时间:2019年9月

运用欧易/鹿明生物技术:GC-MS靶向代谢组学(由鹿明生物提供技术支持
 

研究背景
 

萌发是一个关键的发育过程,它将非休眠种子转化为高度活跃的状态,并对植物的生命周期和农业活动产生重大影响。萌发过程包括三个阶段,包括干种子的吸胀、代谢过程的重新启动和胚根通过种子包膜的突出。萌发过程主要由内部信号级联控制,例如与植物激素相关的信号级联,包括脱落酸(ABA)和赤霉素(GAs),以及环境信号。前期的研究表明甲硫氨酸(Met)在种子萌发中起作用。然而,目前尚不清楚Met是否在AtGLR3.5介导的发芽控制中起作用,以及在这一过程中,氨基酸的来源是哪些细胞机制。
 

研究方法
 

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研究结果
 

1.甲硫氨酸促进种子萌发
 

前期报道已经证明AtGLR3.5调节[Ca2+]和种子萌发。为了确定配体在萌发过程中如何调节AtGLR3.5活性,作者重点研究了已知在萌发过程中含量增加的氨基酸和已报道激活植物GLR Ca2+通道的氨基酸。为此,作者测试了生理浓度(10μM和30μM)下的L-Met、D-Ser、L-Asp和L-Thr在播种后36小时对拟南芥野生型(WT)种子发芽的影响,观察到L-Met以剂量依赖的方式增强发芽,在30μM时效果最佳(图1A,B)。
 

根据时间过程分析进一步证实,有L-Met存在的种子发芽比没有L-Met的种子发芽快(图1C)。由于L-Met对发芽的积极作用与我们之前观察到的Ca2+处理相似,作者接下来测试L-Met的作用是否与Ca2+或Ca2+通道有关。因此,在L-Met与Ca2+通道阻滞剂LaCl3联合处理后,检查种子发芽率。发现LaCl3消除了L-Met的促进作用,导致发芽率低于对照(图1D)。说明L-Met促进种子萌发的作用是通过Ca2+通道实现的,或L-Met激活Ca2+通道促进种子萌发的。

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图1 | L-甲硫氨酸(L-Met)促进拟南芥种子的萌发率

(A)不同L-Met浓度在生长培养基中的种子萌发。

(B)在生长室中存在或不存在30μM L-Met的情况下在36h的萌发表型。

(C)在有或无L-Met(30μM)的情况下种子萌发的时间过程。

(D)Ca2+通道阻滞剂LaCl3对种子萌发的Met调节作用。
 

2.AtGLR3.5介导L-Met依赖的种子萌发
 

由于AtGLR3.5对拟南芥种子萌发至关重要,并且具有Ca2+通道的功能,作者研究了它是否参与了种子萌发的L-甲硫氨酸调节控制。作者检测了AtGLR3.5-RNAi系和AtGLR3.5 T-DNA插入系(AtGLR3.5-1和AtGLR3.5-2)中存在L-Met时的发芽率,结果显示存在L-Me将会大大降低AtGLR3.5转录水平。与WT种子对L-Met的反应增强的发芽率相比,两个独立的AtGLR3.5-RNAi和两个T-DNA插入系在使用L-Met浓度下的发芽率没有明显变化(图2A,B),这表明AtGLR3.5在L-Met介导的发芽中起着关键作用。L-Met和CaCl2 的同时施用比单独施用时更能提高野生种子的发芽率(图2C)。这些结果表明,L-Met对种子萌发的调节作用涉及AtGLR3.5和Ca2+信号。
 

为了获得L-Met调节[Ca2+]cyt中AtGlr3.5依赖性波动的直接证据,作者使用含有Ca指示蛋白YC3.60的植物进行了FRET敏化发射成像分析并监测[Ca2+]cyt变化的动力学。L-Met在WT幼苗的根细胞中触发了[Ca2+]cyt的短暂增加,而这种反应在AtGLR3.5-RNAi幼苗中基本被消除(图2D)。这些数据表明,L-Met激活了AtGLR3.5Ca2+通道,并在种子萌发过程中引起[Ca2+]cyt的增加。
 

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图2 | L-甲硫氨酸(L-Met)诱导拟南芥[Ca2+]cyt的AtGLR3.5依赖性增加

(A)不同浓度L-Met对野生型和AtGLR3.5-RNAi种子萌发的影响。

(B)不同浓度L-Met下WT和AtGLR3.5 T-DNA插入系(AtGLR3.5-1和AtGLR3.5-2)的发芽。

(C)不同处理对WT和AtGLR3.5-RNAi种子萌发的影响。

将种子播种在含有0 mM CaCl2(对照)、0 mM CaCl2和10μM L-Met、1 mM CaCl2、1 mM CaCl2和10μM L-Met、0 mM CaCl2和10 mM EGTA的改良MS培养基上,或添加10μM L-Met和10 mM EGTA的0 mM CaCl2上,在22℃下孵育36h后对发芽率进行评分。t检验显著性差异:**P<0.01。

(D)1 mM L-Met对WT和AtGLR3.5-RNAi植物[Ca2+]cyt依赖的FRET效率的影响。用YC3.60的幼苗初生根进行分析。


3.AtGLR3.5功能由Met调节,Met通过Met合成酶1生物合成
 

在转入萌发条件后0小时和24小时检测了萌发种子中的Met含量。在此期间,WT中的Met含量增加了约1.6倍(图3A)。然后,作者研究了在萌发过程中诱导AtGLR3.5介导的[Ca2+]cyt增加的Met的来源。据报道植物中的Met可以通过从头生物合成或再循环生产。鉴于萌发是植物生命周期中最早的生理步骤,作者将重点放在生物合成上。药理学分析表明,PAG(一种Met合成抑制剂),以剂量依赖的方式延缓发芽(图3B)。PAG显著地阻碍了种子胚根的伸出和萌发(图3C,D),并且通过补充L-Met(图3E)可以在一定程度上减轻这种损害;然而,在AtGLR3.5-RNAi种子中,这种影响要低得多。这些数据表明,Met的从头生物合成对AtGLR3.5介导的萌发至关重要。
 

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图3 | 甲硫氨酸(Met)的生物合成在拟南芥种子萌发的AtGLR3.5-modualtion中起作用

(A)野生型(WT)种子在萌发条件下孵育后0小时和24小时的Met含量。

(B)不同浓度甲基生物合成抑制剂DL-丙炔甘氨酸(PAG)对野生种子萌发的影响。

(C)有或无PAG存在时WT种子的萌发表型。

(D)PAG存在或不存在时种子萌发的时间过程。种子在与(C)相同的培养基中播种,并在22°C下培养。

(E)AtGLR3.5-RNAi种子在PAG(1 mM)或PAG+Met(30μM)存在下发芽。
 

Met在植物中由OPH(O-磷酸高丝氨酸)通过三个连续的酶反应合成。拟南芥基因组含有三种Met合酶(AtMS)基因的功能亚型。为了确定是哪一种导致了种子萌发所需的Met的产生,作者进行了定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)分析,发现在萌发过程中AtMS1(At5g17920)的表达出现很大的变化(图4A)。AtMS1的转录水平在萌发开始后24小时达到高峰,然后逐渐下降,直至萌发结束。qRT-PCR数据表明,在萌发条件下培养24小时后,由AtMS1的2.0-kb启动子序列驱动的表达GUS报告基因的转基因种子的GUS活性显著增加(图4B)

为了进一步评估AtMS1在发芽过程中的作用,作者分离了一个T-DNA插入突变体AtMS1,其AtMS1转录水平降低。在萌发条件下,Atms1突变体在0小时和24小时产生的Met量均低于WT种子(图4C),因此表明Atms1在萌发期间Met生物合成中的作用。有趣的是,与WT(图3A)相比,突变体中的Met含量在0 h到24 h之间下降(图4C),这可能是由于在萌发期间消耗了大量Met和突变体中合成的Met量较低所致。突变株在24小时与0小时的Met含量之比远低于WT(图4D),这表明突变株有较少的Met可用于促进萌发。与此结果一致,Atms1种子的发芽率相对于WT降低(图4E)。在外源性添加L-Met(30μM)的情况下,野生型和突变体的发芽率均增加,但在Atms1种子中的发芽率相应增加(图4F),这意味着降低的Met水平是导致突变体发芽率降低的原因。综合实验相关的结果,说明了AtMS1衍生的Met在AtGLR3.5调控种子萌发中起着重要作用。
 

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图4 | 来自AtMS1的甲硫氨酸(Met)对拟南芥种子萌发具有正向调节作用

(A)种子萌发过程中AtMS1、AtMS2和AtMS3表达的qRT-PCR分析。

(B)AtMS1在种子胚中的表达模式由AtMS1pro::GUS指示。

(C)WT和Atms1种子中的Met含量。

(D)根据(C)中的结果,在24h与22℃下在0h的WT和Atms1种子中的Met含量之比。

(E)WT和Atms1种子的萌发。

(F)WT和Atms1种子经过或不经过L-Met处理后的萌发。


4. Met对萌发种子中AtGLR3.5和ABI4表达的差异调节
 

然后作者为了进一步研究Met的调节作用,检测了它对AtGLR3.5表达的影响。如(图5A)所示,添加L-Met上调了AtGLR3.5的表达,而Met生物合成抑制剂PAG降低了其表达。在Met含量较低的Atms1突变体中,AtGLR3.5转录水平显著低于WT(图5B)。这些数据表明,除了激活AtGLR3.5通道外,L-Met还上调了萌发种子中AtGLR3.5的表达。在之前的研究中,观察到[Ca2+]cyt的AtGLR3.5介导增加抑制萌发种子中ABI4的表达。因此,作者研究了Met对ABI4表达的影响。结果发现L-Met降低ABI4的表达,而PAG增加其表达(图5C)。此外,Atms1突变体中ABI4的转录水平比野生型高约6倍(图5D)。总之,这些结果表明,L-Met在种子萌发过程中作用于AtGLR3.5-Ca2+-ABI4级联的上游,并拮抗AtGLR3.5和ABI4的功能。
 

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图5 | 甲硫氨酸(Met)对拟南芥AtGLR3.5和种子萌发关键调控因子ABI4表达的调节

(A)野生型(WT)种子经L-Met(30μM)或PAG(1 mM)处理后AtGLR3.5表达的qRT-PCR分析。

(B)AtGLR3.5在WT和Atms1种子中的表达。

(C)ABI4在WT种子中的表达对L-Met(30μM)或PAG(1 mM)的响应。

(D)ABI4在WT和Atms1种子中的表达。

研究结论
 

本研究中,作者证明L-Met通过上调AtGLR3.5介导的细胞溶质Ca2+信号促进拟南芥种子萌发。同时表明,L-Met对种子萌发有积极的调节作用,但这需要拟南芥AtMS1、L-Met激活AtGLR3.5Ca2+通道、调节ABI4的表达,进而促进种子萌发。
 

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本文运用GC-MS靶向代谢组学报道了拟南芥AtMS1(甲硫氨酸合酶1)在Met生物合成的最后一步,合成了激活AtGLR3.5 Ca2+通道所需的Met,该通道在萌发过程中表达上调,导致种子萌发的调节。作者发现外源L-Met以AtGRL3.5依赖的方式促进发芽。作者还证明了L-Met直接调节AtGLR3.5介导的幼苗胞浆Ca2+的增加。作者提供了通过AtMS1合成的Met作用于AtGLR3.5介导的Ca2+信号上游并调节种子脱落酸反应主要调节因子ABI4表达的药理学和遗传学证据。总之,作者的研究结果与AtMS1、L-Met、AtGLR3.5Ca2+通道、Ca2+信号和ABI4有关,揭示了L-Met在种子萌发中的生理作用和分子机制。


参考文献:

Chuanli Ju, Dongdong Kong, Yuree Lee, et al. Methionine Synthase 1 Provides Methionine for Activating AtGLR3.5 Ca2+ Channel and Regulating Germination in Arabidopsis[J]. Journal of Experimental Botany, 2019.
 

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文章来源于鹿明生物

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