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项目文章 | 泰达心血管医院何国伟团队用蛋白组学+代谢组学揭示先天性心脏病的潜在生物标志物

前言
 

2020年09月欧易/鹿明生物合作客户天津泰达国际心血管病医院何国伟教授团队在American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology发表了题为“Protein Biomarkers and Risk Scores in Pulmonary Arterial Hypertension Associated with Ventricular Septal Defect: Integration of Multi-Omics and Validation ”的研究成果,通过蛋白组学GC-MS代谢组学研究方法,探索先天心脏病中室间隔缺损伴有肺动脉高压(VSD-PAH患者)发生显著改变的途径并揭示其潜在的生物标志物。
 

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中文标题:蛋白组学和代谢组学筛选室间隔缺损伴有肺动脉高压的标志物和风险因子

研究对象:人血浆

发表期刊:American Journal of Physiology-Lung Cellular and Molecular Physiology

影响因子:4.406

合作单位:天津泰达国际心血管病医院

发表时间:2020年09月14日

主要运用欧易/鹿明生物技术:iTRAQ蛋白质组学和GC-MS代谢组学(由鹿明生物提供技术支持)
 

研究背景
 

先天性心脏病(CHD)是先天性畸形中最常见的一类,指在胚胎发育时期由于心脏及大血管的形成障碍或发育异常而引起的解剖结构异常,或出生后应自动关闭的通道未能闭合的情形。室间隔缺损(VSD)被认为是最常见的先天性心脏病。大多数冠心病具有特定的血液动力学,其中一些会发展为肺动脉高压(PAH)和其他并发症。近年来,对PAH导致细胞代谢,氧化应激,过氧化物酶体激活的受体-γ,性激素,炎症,去极化,Ca2+过载和细胞外基质等信号通路进行了深入的研究,但并未发现可靠的诊断和治疗的生物标志物。本研究进行了血浆蛋白组学代谢组学分析,以探索VSD-PAH患者中显著改变的途径并揭示潜在的生物标志物。
 

研究思路
 

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实验结果
 

1.蛋白质组学和代谢组学研究
 

iTRAQ蛋白质组学鉴定了62,419个肽段和427个蛋白。在427个蛋白中,107个蛋白显著变化(FC > 1.2或<0.83)。三组分别有52(VSD-PAH vs VSD-control),68(VSD-PAH vs Healthy control)和42(VSD-Control vs Healthy control)个差异蛋白被鉴定到(图1A)。其中,ECM(TSP1)、TKFC、血红蛋白(HBA,HBB)、补体蛋白(C1QA,C1QB,C1QC)和免疫球蛋白家族(IGHG3,IGHA1,KV122)在VSD-PAH中显著差异表达(图1B)。纤维蛋白原家庭(FIBA,FIBB,FIBG)在VSD-Control组中显著上调表达,在VSD-PAH组中显著下调表达。在Healthy control组中,角蛋白家族(K1C10,K2C1)蛋白显著高表达。免疫球蛋白(K V 2 0 4,KV307,IGJ,IGHM,IGKC,IGHD,IGHA1,IGHG3,HV102,HV101,HV209,HV301)在其他两个VSD组中显著低表达,表明健康对照组的受试者处于正常的免疫反应状态。 此外,VSD-PAH和VSD-control中显著差异的蛋白分别是:PPM1L,HBA,HBB,NOE1,THIO,TFB2M,ETAA1,WFD11,KMT2D和MAGI1。
 

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图1 | 蛋白组分析结果

(A)在3个比较组中的venny分析;

(B)在3个比较组中的差异蛋白;

(C)显著差异变化的top 40蛋白水平表达柱形图;

(D)显著差异变化的top 40蛋白水平表达柱形图。


GC-MS代谢组学鉴定出1,468个特征峰和438个代谢物,其中191个为显著变化的代谢组;111个在VSD-PAH和VSD-control中显著变化,117个在VSD-PAH和Healthy control中显著变化,101个在VSD-control和Healthy control中显著变化。
 

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图2 | 代谢组分析结果

(A)PCA分析和OPLA-DA分析;

(B)在3个比较组中的差异代谢物venny分析图;

(C)聚类热图;

(D)显著差异变化的top 40代谢物水平表达柱形图。
 

在VSD-PAH vs VSD-Control比较组中,52个蛋白显著变化,包括34个上调和18个下调蛋白(图3)。其中19个蛋白显著富集在KEGG pathway中,包括complement and coagulation cascades, staphylococcus aureus infection, prion diseases, platelet activation, chagas disease (American trypanosomiasis), malaria, pertussis, ECM-receptor interaction, hematopoietic cell lineage, african trypanosomiasis, rap1 signaling pathway, systemic lupus erythematosus, and phagosome pathways。另外9个蛋白显著富集在cAMP, HIF-1-, PPAR-FoxO-signaling pathways, and Glutathione metabolism, Tyrosine metabolism, Fructose and mannose metabolism, Folate biosynthesis, and Huntington's disease。PPI网络分析表明:发现2个biological processes (response to stress and to wounding),2个KEGG途径(platelet activation and ECM-receptor interaction)与疾病显著性相关。FN1,FGB和THBS1在VSD 中扮演了最重要的角色。ANPEP参与谷胱甘肽代谢途径和GGH参与叶酸生物合成(图3E)。
 

为了分析VSD-PAH and VSD-Control之间的差异代谢物,这些差异代谢物富集到52个代谢通路中。然而,仅有5个代谢通路中同时含有差异蛋白和差异代谢物,如(1)叶酸生物合成,(2)赖氨酸降解,(3)pathways in cancer,(4)胆固醇代谢和(5)谷胱甘肽代谢(图3F)。
 

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图3 | VSD-PAH and VSD-Control的蛋白组和代谢组的联合分析结果

(A)top的差异蛋白;

(B)GO富集分析;

(C)KEGG富集分析;

(D)22条pathways的百分比分布图;

(E)PPI互作网络图;

(F)差异蛋白和代谢物的整合分析。


2.候选蛋白的ELISA验证
 

在validation phase中,共收集VSD-PAH(n = 30),VSD-control(n = 30)和healthy-control(n = 20)这3组样本,对ADIPO,ANPEP,DBH,GP1BA,GNAS,TRF1这6个蛋白采用ELIS1A做进一步验证。在VSD-PAH中ADIPO水平显著高于VSD患者和健康对照者(116.58±6.51 ng / ml vs 97.92±5.46 ng / ml vs. 75.10±5.41 ng / ml)。DBH与ADIPO的表达趋势相同(43.31±4.81 ng / ml vs. 31.30±3.94 ng / ml vs 15.46±1.56 ng / ml)。ANPEP在VSD-PAH中的水平显著高于VSD患者和健康对照。
 

与VSD-Control相比,TRF1和GP1BA在VSD-PAH组中显著升高。VSD对照组(3.85±0.38ug / ml,n = 30)。相反,与VSD-Control相比,GNASA在VSD-PAH组中显著降低。

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图4 | VSD-PAH and VSD-Control的6个蛋白的表达水平柱形图

(A)iTRAQ蛋白组中的表达水平(Discovery phases);(B)ELISA中的表达水平。


3.候选pathway分析
 

鉴定了两种不同的通路途径网络,包含6个候选蛋白质和15个差异代谢物。
 

第一类通路网络包括cAMP信号通路,ECM-受体互作,AMPK信号通路,HIF-1信号通路,PI3K-Akt信号通路和drug nepicastat hydrochloride monohydrate,这些信号通路中涉及的蛋白和代谢物包括:DBH,GNAS,GP1BA,TFR1和ADIPO以及差异代谢物vanillylmandelic acid, 3,4-dihydroxymandelate, 5-HT, 15-Keto-PGF2 and fructose-6-phosphate (F-6-P)。
 

第二类通路网络包括涉及许多氨基酸和代谢级联反应通路,如glutathione metabolism, cysteine and methionine metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, D-glutamine and D-glutamate metabolism, and tyrosine metabolism,这些代谢通路中涉及的蛋白和代谢物包括:ANPEP and DBH以及差异代谢物1-aminocyclopropane-1-carboxylate, L-cystine, 2-oxobutanoate, threonine, creatine, sarcosine, hydroxypyruvate, taurine, dehydroascorbate, L-glutamine, vanillylmandelic acid, 3,4-dihydroxymandelate。
 

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图5 | VSD-PAH中的关键信号传导途径(A)和氨基酸代谢途径(B)


4.候选信号通路与VSD-PAH的关联分析
 

根据YI和人群分布对DBH,ANPEP,ADIPO蛋白进行了分层分析。二元逻辑回归分析这六种蛋白与VSD-PAH的相关性,研究表明:DBH≥28.8 0ng/ml,ADIPO≥111.10ng/ml,ANPEP≥299.8pg/ml与PAH独立相关。40%的VSD-PAH患者的risk scores ≥ 7;53.3%的VSD-Control患者的risk scores ≤ 4。基于上述分析表明:risk scores ≥7的阳性预测值为100%,risk scores ≤4的阴性预测值为100%。因此DBH,ADIPO和ANPEP可以认为是VSD-PAH的新型生物标志物。total risk score ≥ 7是VSD患者发展为PAH的一个高危因子,total risk score ≤ 4是一个阴性指标。
 

DBH,ADIPO,和ANPEP的诊断潜能为AUC(95%CI)0.65(0.51-0.80),0.74(0.61-0.87)和0.78(0.67-0.90)。此外,蛋白(DBH,ADIPO和ANPEP)和total risk scores的联合诊断潜能为AUC(95%CI)0.87(0.78-0.96)(P <0.0001),表明对PAH的发生有良好的预测价值。
 

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图6 | DBH, ANPEP, ADIOPO的ROC分析

实验结论
 

通过iTRAQ蛋白组学GC-MS代谢组学的方法,探索VSD-PAH患者中显著改变的途径并揭示潜在的生物标志物。鉴定了两种不同的通路途径网络,包含6个候选蛋白质和15个差异代谢物。
 

第一类通路网络包括cAMP信号通路,ECM-受体互作,AMPK信号通路,HIF-1信号通路,PI3K-Akt信号通路和drug nepicastat hydrochloride monohydrate。
 

第二类通路网络包括涉及许多氨基酸和代谢级联反应通路,如glutathione metabolism, cysteine and methionine metabolism, taurine and hypotaurine metabolism, glycine, serine and threonine metabolism, D-glutamine and D-glutamate metabolism, and tyrosine metabolism。
 

此外,DBH,ADIPO,和ANPEP的诊断潜能为AUC(95%CI)0.65(0.51-0.80),0.74(0.61-0.87)和0.78(0.67-0.90)。此外,蛋白(DBH,ADIPO和ANPEP)和total risk scores的联合诊断潜能为AUC(95%CI)0.87(0.78-0.96),表明对PAH的发生有良好的预测价值,可以作为后续疾病诊断的生物标志物。
 

小鹿推荐
 

通过蛋白质组学GC-MS代谢组学的多组学方法,在发现阶段鉴定到与VSD-PAH显著相关的蛋白和代谢物,并发现与其显著相关的信号通路。此外,对鉴定到的候选蛋白在验证集中进行再次验证。随后分析了蛋白表达水平与风险因子的相关性,以评估其这些蛋白标志物的诊断潜能。本文为较为典型的生物标志物研究思路,因此具有一定的借鉴意义。
 

参考文献:

Yuan C, Chen HX, Hou HT, Wang J, Yang Q, He GW. Protein Biomarkers and Risk Scores in Pulmonary Arterial Hypertension Associated with Ventricular Septal Defect: Integration of Multi-Omics and Validation. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol. 2020 Sep 2. PMID: 32877226.
 

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文章来源于鹿明生物

 

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