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项目文章 JCC | LC-MS非靶代谢组学助力南京大学朱维铭、李毅团队喜登IF=8.658医学顶刊

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前言
 

2020年5月欧易/鹿明生物合作客户南京大学医学院朱维铭李毅课题组在Journal of Crohn's and Colitis期刊(IF=8.658)发表了题为 “Disturbance of Fatty Acid Desaturation Mediated by FADS2 in Mesenteric Adipocytes Contributes to Chronic Inflammation of Crohn's Disease ”的研究成果,通过LC-MS非靶向代谢组学研究方法,发现了炎症肠系膜脂肪细胞和巨噬细胞表型转化中有效调的节的细胞因子:FADS2,探究了肠系膜脂肪细胞的代谢谱以及在CD背景下关键代谢变化与局部炎症之间的相关性,描绘了肠系膜脂肪细胞的代谢谱,为治疗慢性炎症性的克罗恩病提供了理论依据。
 

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中文标题:肠系膜脂肪细胞中由脂肪去饱和酶(FADS2)介导的脂肪去饱和紊乱导致克罗恩病慢性炎症

研究对象:人的脂肪组织

发表期刊:Journal of Crohn's and Colitis

影响因子:8.658

发表时间:2020.5.4

发表单位:南京大学医学院附属金陵医院、青岛大学附属医院、南京大学医学院附属鼓楼医院、北京大学人民医院、中科院遗传与发育生物学研究所

运用欧易/鹿明生物技术:LC-MS非靶代谢组学(由鹿明生物提供技术支持)
 

研究背景
 

CD是一种慢性炎症性肠病,常有特征性的肠系膜脂肪增生,该脂肪组织(肠系膜脂肪组织,MAT)包裹在炎症肠管周围,形成爬行脂肪(creeping fat)。最近的研究数据表明,MAT可以作为CD过程中的炎症“输入”。脂肪细胞除了具有独特的免疫塑形功能外,还可以作为主要的脂质储库并维持肠系膜的代谢稳态。在CD患者中,肥大性MAT(htMAT)在脂质存储,脂肪生成和脂肪分解中发生功能失调,使得代谢稳态可能受损。CD患者的爬行脂肪似乎含有多余或甚至无法使用的脂质,这些脂质在长期消耗条件下无法提供能量,而是通过脂质介质(LMs)的异常分泌参与破坏MAT微环境中的免疫状态。

迄今为止,肠系膜脂肪细胞的代谢谱和异常代谢过程影响局部炎症的确切机制尚未完全阐明。FADS2是连接CD炎症和代谢状态的关键酶,那么CD患者体内关键代谢变化与局部炎症之间存在着哪些相关性?本文就这一问题进行了深入的探究。
 

研究思路

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研究方法
 

实验材料:实验对象为人的脂肪组织,分为CD组和非CD组。其中,CD组进行了回肠切除术,其中包括切除肠系膜。样品来自患病回肠旁的肥厚性肠系膜脂肪组织(htMAT)和正常的肠系膜脂肪组织(nMAT)处(切除回肠后留下的正常组织),分为病变组和切缘组。非CD病是被诊断为结肠癌并进行了右半结肠切除术的个体的回肠样本和正常对照组织的MAT(Control),为对照组。每组各10个生物学重复。


多组学分析:LC-MS非靶向代谢组学实验+脂质组学
 

检测方法:

(1)生理生化实验:脂肪酸的测定(GC);

(2)功能验证实验:qRT-PCR检测mRNA表达量,Western blot和ELISA法检测蛋白表达量、流式细胞仪检测巨噬细胞极化,免疫组化染色观察形态学变化。


研究结果
 

1、代谢组学特征突显了 CD患者的MAT中不饱和脂肪酸生物合成的缺陷
 

作者对人脂肪样品进行了代谢组学分析,MAT样品中的代谢物的表达模式以热图的形式呈现,其结果显示了CD患者htMAT的独特代谢产物谱(图1)。在htMAT中上调的代谢物中,我们鉴定出几种多不饱和脂肪酸的前体,包括亚麻酸,α-和β-亚油酸。

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图1 | 人肠系膜脂肪组织不同的代谢亚群

(A)病变组(CD htMAT)、切缘组(CD nMAT)和对照组(非CD)代谢物分布的聚类热图(每组10个重复);

(B)三组中差异代谢物的Venn图。A:htMA T;B:nMA T;C:对照组;

(C)差异代谢物的火山图;

(D)正交偏最小二乘方-判别分析(OPLS-DA);
 

气泡图分析如图2 所示,通过对照组与nMA-T、对照组与htMA-T和nMA-T与htMA-T的比较,表明 CD患者肠系膜脂肪细胞存在异常的不饱和脂肪酸代谢。

不饱和脂肪酸的代谢途径如图3 A所示。几种必需的多不饱和脂肪酸(如AA、EPA和DHA)来源于前体亚油酸(LA;18:2n6)和α-亚麻酸(ALA;18:3n3)的延伸和去饱和。为了评估不饱和脂肪酸合成的变化,作者通过检测对照组和CD组中MAT脂肪酸的组成,发现CD患者的MAT中的FADS2活性降低。
 

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图2 | 显著性富集通路气泡图展示


2、与CD相关的慢性炎症患者其脂肪细胞的肠系膜脂肪组织(MAT)中的FADS2下调
 

与对照组和nMAT组相比,CD患者htMAT中FADS2的mRNA表达显著降低(图3 B)。DAPI和FADS2共染色显示FADS2蛋白主要定位于脂肪细胞膜(图3 C)。免疫组化染色和WB结果进一步证实了,CD患者htMAT中FADS2表达量的减少(图3 D和3 F)。通过对回肠样本及相连的MAT进行病理检查,证实CD患者的炎症水平较高。
 

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图3 | FADS2在肠系膜脂肪细胞中的表达及在CD患者的肠系膜脂肪组织中表达量的减少

(A)n-3和n-6脂肪酸生物合成途径;

(B)催化延伸和去饱和反应的酶的表达;

(C)小提琴图表示四个时间点上某些代表性被检测物质的丰度情况;

(D)脂肪细胞FADS2免疫组化染色;

(E)western印迹结果显示FADS2在htMA-T中的表达较低(H:htMAT,N:nMAT,C:control);

(F)脂肪细胞FADS2表达的定量分析;


3、FADS2过表达改变巨噬细胞极化并抑制肠系膜脂肪细胞的炎症反应
 

为了研究FADS2基因在人肠系膜脂肪细胞中的作用,本研究通过使用FADS2基因以及FADS2-siRNA慢病毒载体进行过表达和干扰来改变FADS2的表达水平(图4 A)。

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图4 | 细胞培养及处理

(A)脂肪细胞THP1巨噬细胞的培养系统示意图;

(B)使用油红染色及细胞流式仪对原代肠系膜脂肪细胞的分离,培养及验证的步骤;

(C)WB验证对照组和CD患者的原代脂肪细胞转染慢病毒载体后FADS2的表达量;
 

之后,研究了正常肠系膜脂肪细胞分泌的可溶性因子对炎症脂肪细胞的影响。发现FADS2过度表达的MAT脂肪细胞可以抑制肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和C-反应蛋白(CRP)的分泌(图5)。

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图5 | 具有高FADS2表达的对照脂肪细胞的ACM负调节发炎脂肪细胞中的炎症反应并增强M2极化

(A)(B)和(D)ELISA测定不同上清液处理的htMAT脂肪细胞培养基中C反应蛋白、TNF-α和脂肪因子的水平;

(C-E)WB分析来自对照受试者的转染MAT脂肪细胞的上清液处理的与htMAT分离的脂肪细胞的TLR/NF-κb和ERK1/2信号通路;

(F)经典活化巨噬细胞(M1型巨噬细胞)和选择性活化巨噬细胞(M2型巨噬细胞)流式检测;
 

研究人员对炎症的肠系膜脂肪细胞重复FADS2干扰实验,结果表明,FADS2在肠系膜脂肪细胞中的表达影响脂肪细胞的炎症和巨噬细胞的活化(图6)。

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图6 | FADS2调节脂肪细胞炎症和巨噬细胞表型

(A)经FADS2慢病毒(lv-FADS2)、FADS2-siRNA(siRNA)、载体和PBS(对照)处理的炎症脂肪细胞中C反应蛋白和TNF-α蛋白水平检测;

(B)WB法检测htMAT不同上清液处理的脂肪细胞的脂联素和瘦素水平;

(C)THP1巨噬细胞与来自炎症脂肪细胞的不同ACM样品孵育产生细胞因子的mRNA水平;

(D)不同的脂肪细胞ACM样品处理THP1巨噬细胞的流式细胞术分析;


4、由促分解脂质介质介导的FADS2过度表达对抗炎作用的影响
 

综上所述,FADS2可作为炎症肠系膜脂肪细胞和巨噬细胞表型转化中细胞因子释放的有效调节剂。为探究脂肪细胞和ACM的脂质组分是否会随着FADS2水平的变化而发生改变,研究人员通过LC-MS代谢组学检测分析未处理、FADS2过表达(FADS2慢病毒)和敲除FADS2的脂肪细胞(FADS2 siRNA)中的脂肪酸,发现在FADS2过表达的脂肪细胞中n-3 PUFA的生物合成增强,DHA / EPA掺入增加,表明FADS2参与了EPA和DHA的细胞保留,从而改变细胞膜的组成和流动性,有助于控制发炎脂肪细胞内的炎症。
 

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图7 | FADS2调节非分泌性多不饱和脂肪酸成分的细胞组成

(A)脂肪细胞及其培养基中必需多不饱和脂肪酸的比例;

(B)处理后脂肪细胞及其培养基的PUFA比率;
 

然而,FADS2过表达的脂肪细胞的ACM并没有显示出更高的n-6:n-3 PUFA比,也没有显示出EPA和DHA富集,这表明FADS2对PUFAs的分泌没有影响(图7)。由于这些多不饱和脂肪酸是炎症的发生和消退过程中至关重要的脂质介质,研究人员对对ACM中的PUFA代谢物进行了聚类分析(图8 A)。结果表明FADS2的过表达增加了抗炎脂质的水平,降低了促炎脂质的水平(图8)。

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图8 | LC-MS/MS脂质组分析结果显示脂肪细胞中有明显的由FADS2调节的脂质介质分泌

(A)对照组、FADS2过表达及FADS2沉默的肠系膜脂肪细胞的多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢组热图;

(B)基于PUFA代谢物分析的PCA图。(Group 1, 对照; Group 2, FADS2 过表达;Group 3, FADS2 基因敲除);

(C)PUFA中代谢物的含量;

(D)各种脂质介质受体的表达强度;

5、FADS2-AAV减轻IL-10-/-小鼠的MAT及黏膜炎症
 

因为IL-10-/-小鼠具有MAT肥大的特征,研究人员以这些小鼠为研究对象来确定FADS2的过度表达是否能促进小鼠体内MAT和肠道炎症的消退。有趣的是,通过腹腔注射FADS2-AAV,可增加肠系膜脂肪细胞中FADS2的表达,但它并没有影响肝组织中FADS2的表达(图9 B)。
 

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图9 | 腹腔注射FADS2过表达的AAV可减轻黏膜和肠系膜炎症

(A)实验计划流程图;

(B)在腹腔注射高表达的FADS2-AAV后,观察到FADS2在MAT中上调,但在IL-10 KO小鼠的肝脏中没有上调;

(C)用伊红染色法观察结肠组织切片和肠系膜脂肪组织切片从而显示FADS2-AAV的作用;

(D)(E)FADS2-AAV治疗显著增加结肠长度,减轻组织学炎症评分;

(F)(G)MAT相关的FADS2过表达降低了MAT的重量和每个区域的脂肪细胞数量;

(H)(I)由DAI评分和体重减轻的临床症状在用FADS2过表达载体治疗的II-10-/-小鼠中均得到显著改善;
 

与未经治疗的IL-10-/-小鼠相比,FADS2过表达小鼠每一区域的脂肪细胞数量减少,MAT内的免疫细胞浸润减少(图9C,G)。该结果表明FADS2-AAV治疗减弱了IL-10-/-小鼠的MAT和黏膜炎症(图9)。且FADS2表达的增加会减轻脂肪细胞炎症,并使得局部巨噬细胞的免疫表型发生转化(图10)。

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图10 | MAT中FADS2表达的增加导致脂肪细胞炎症的减轻和局部巨噬细胞的免疫表型转化

(A)促炎性脂肪因子瘦素水平因FADS2过度表达而升高,而抗炎性脂肪因子脂联素水平则下降;

(B)巨噬细胞标志物的mRNA表达改善了M2表型;

(C)将冷冻的MAT切片染色以结合所有表型的巨噬细胞的抗F4/80(绿色)和结合M2巨噬细胞的抗CD206(红色)。M2巨噬细胞是F4/80+/CD206+(橙色);
 

6、促炎细胞因子诱导肠系膜脂肪细胞中FADS2表达缺失,过氧化物酶体增殖激活受体(PPAR-α)参与FADS2的激活
 

为研究炎症因子对FADS2的影响,研究人员在原代肠系膜脂肪细胞中检测了TNF-α和IL-6(8h和24h)对FADS2 mRNA表达水平的慢性作用(图11)。之前的研究表明FADS2在转录水平上受甾醇调节元件结合蛋白-1c(SRBP-1c)和过氧化物酶体增殖激活受体α(PPAR-α)调节。经后续实验证明,在促炎细胞因子诱导肠系膜脂肪细胞中FADS2表达缺失的情况下,PPAR-α可参与TNF-α和IL-6刺激的原代脂肪细胞中FADS2的激活。

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图11 | 脂肪细胞在FADS2调控中的作用机制

(A)FADS2在IL-6和TNF-α刺激的原发内脏脂肪细胞中的表达谱;

(B)(C)IL-6、TNF-α和合成配体WY-14643联合处理对处理12h后的FADS2蛋白表达的影响;

(D)qRT-PCR分析各组中FADS2和PPAR-α水平。对照组和htMAT组中,FADS2与PPAR-α水平的显著相关(n = 10;Person's相关分析);

(E)FADS-2和PPAR-α的mRNA水平在不同组间表现出相似的趋势。(n = 10;学生双尾t检验);

(F)调控FADS2表达的候选转录因子的WB分析;

(G)(H)转染后脂肪细胞中FADS2的WB和定量分析;

相关讨论
 

本研究旨在探讨CD环境下代谢性炎症的机制。基于不同代谢物的代谢组学分析表明,与对照组相比,CD期间存在异常的不饱和脂肪酸(PUFA)水平,参与长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)多步合成的代谢物水平发生了显著变化。气相色谱分析显示n-6和n-3途径的去饱和通量受损,这与人肠系膜组织中FADS2活性降低有关。另外,通过体外体内FADS2过表达试验,证明FADS2对促炎性细胞因子(CRP和TNF-α)和脂肪因子(leptin)产生抑制作用,同时强化M2巨噬细胞的极化,使巨噬细胞产生抗炎作用。
 

由FADS2介导的脂肪去饱和紊乱导致慢性炎症的示意图如下图所示。在受CD影响的肠系膜脂肪组织中,包括IL-6和TNF-α在内的炎症刺激会导致FADS2早期下调。较低水平的FADS2影响了n-3 PUFA(包括EPA和DHA)的生成,从而破坏了生物活性类花生酸的分泌。在MAT环境中基质中不平衡的分泌体促使局部巨噬细胞和脂肪细胞进入炎症敏感状态,并诱导脂肪细胞的炎症反应。活化的脂肪细胞和巨噬细胞进而导致脂肪细胞中PUFA代谢功能异常,形成恶性循环。在肠系膜脂肪中靶向PPAR-α的干预可以改善脂肪细胞的代谢功能障碍,并在炎症发作和解决过程中破坏恶性循环。

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实验结论
 

该研究表明克罗恩病(CD)患者肠系膜脂肪细胞具有多不饱和脂肪酸(PUFA)代谢紊乱的特征,即肠系膜脂肪组织内脂肪酸饱和度降低和脂质介质失衡可能会导致慢性炎症性的CD。另外,该研究发现FADS2在代谢和炎症稳态中起着中心作用,FADS2可能通过影响脂类代谢物的生物合成和炎症因子的释放从而影响CD的发生。因此,FADS2有望成为治疗CD病症的药物。


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本研究第一次使用非靶向代谢组学方法来研究克罗恩病症对人体内PUFAs代谢的影响,以及FDAS2对细胞代谢及炎性反应的影响,从而为解析由DAS2介导的脂肪去饱和紊乱导致慢性炎症性的克罗恩病症的作用机制提供进一步的理论依据。主要的研究结果如下:

(1)CD患者MAT中参与长链多不饱和脂肪酸(PUFAs)多步合成的代谢产物水平发生了显著变化;

(2)气相色谱分析显示n-6和n-3途径的去饱和通量受损,这与人肠系膜组织中FADS2活性降低有关;

(3)在CD患者手术样本中通过检测证实了在mRNA和蛋白质水平上FADS2表达均降低;

(4)FADS2表达的恢复,使得n-3脂肪酸内源性转化为可分解的脂质介体,导致促炎性巨噬细胞浸润显著减少,并减弱了炎症细胞因子或脂肪因子的表达。
 

综上所述,本研究使用LC-MS非靶向代谢组学确定肠系膜脂肪组织的代谢谱,并且评估了CD肠系膜脂肪细胞中PUFA的代谢功能障碍,阐明了FADS2在维持PUFA炎症和分解脂质代谢产物中的重要作用。这项研究将有助于开发治疗CD的新策略。
 

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参考文献:

1.Ajay, C., K.D. Nguyen, and Y .P .S. Goh, Macrophage-mediated inflammation in metabolic disease. Nature Reviews Immunology, 2011. 11(11): p. 738.

2.Lynch, L., et al., Regulatory iNKT cells lack expression of the transcription factor PLZF and control the homeostasis of Treg cells and macrophages in adipose tissue. Nature Immunology,2015. 16(1): p. 85-95.

3.Zhang, X., et al., Metabolite profiling of plasma and urine from rats with TNBS‐ induced acute colitis using UPLC‐ ESI‐ QTOF‐ MS‐ based metabonomics – a pilot study. Febs Journal, 2012. 279(13): p. 2322-2338.
 

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文章来源于鹿明生物

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