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酵母文库及蛋白质组学助力鹿明生物合作客户喜登NC(IF:12.121) 

前言

2020年10月欧易/鹿明生物合作客户中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室姚善国研究组储成才研究组Nature Communications发表的题为“Natural variations of SLG1 confer high-temperature tolerance in indica rice”的研究成果,运用酵母文库及iTRAQ蛋白质组学发现了tRNA硫醇化途径中的关键基因SLG1在水稻抵抗高温胁迫中的重要功能。

 

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中文标题:tRNA硫醇化途径关键基因SLG1在水稻抵抗高温胁迫中的机制研究

研究对象:水稻

发表期刊:Nature Communications

影响因子:12.121

发表时间:2020年10月30日

合作单位:中国科学院遗传与发育生物学研究所植物基因组学国家重点实验室

运用欧易/鹿明生物技术:iTRAQ蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)、酵母文库
 

研究背景
 

近些年,全球气候变暖所造成的高温胁迫持续影响着水稻的产量和品质,挖掘水稻耐高温基因,对于改良水稻品种耐热性至关重要。另一方面,传统的籼粳稻由于起源地和种植范围的差异,对于温度的适应性也有很大差别,籼稻种植在温度较高的地区,一般对高温有更强的抵抗能力,但其中的遗传基础尚不清楚。tRNA硫醇化(mcm5s2U34) 是一种重要的tRNA转录后修饰形式,在酵母、线虫、人类中的研究表明,tRNA硫醇化对于维持生物体正常发育和代谢、响应环境胁迫尤其是热胁迫等方面发挥着重要作用。然而,植物中tRNA硫醇化在高温胁迫响应中的功能仍然未知。
 

研究结果
 

1、 SLG1在水稻耐热性中发挥正调控作用
 

通过筛选以KY131(温带粳稻,Tej)为背景的NaN3诱变M2文库,鉴定出了具有细长植物结构和增加了粒长的突变体slg1(图1a,b)。在slg1和KD8(温带粳稻)的F2群体中,候选基因座直接定位到12号染色体的标记C1和C5之间(图1c)。对834个具有突变表型的F2个体进一步分析,将目标基因缩小到了标记C4和C6之间的310 kb区域内(图1c)。序列比较表明,突变体中LOC_Os12g39840的第5个内含子的剪接受体位点存在突变位点(从G到A)(图1c),导致错剪和形成多个转录本。所有21个独立的T2转基因品系(slg1-C)均显示出与WT类似的总体表型,包括粒长和植物结构(图1a,b)。SLG1-RNAi转基因植物表现出与slg1相似的表型(图1a,b),证实LOC_Os12g39840确实是slg1突变体的致病基因。
 

SLG1编码一个保守的细胞质tRNA 2-硫化蛋白2(RCTU2),它的功能缺陷会导致水稻体内的tRNA硫醇化水平缺陷,并伴随明显的高温敏感表型;而过表达SLG1则可显著提高水稻对高温耐受性。slg1是高度热敏性的,约45%的突变幼苗在45°C处理44 h后死亡,而恢复后90%以上的WT存活(图1e);同样,高温处理后SLG1-RNAi植物的存活率也显著降低(图1f和图1f)。相反,在相同的胁迫条件下,SLG1-OE幼苗的存活率(> 90%)比野生型(≈60%)要高得多(图1g),SLG1-OE粒长和植物构型与野生型相似(图1a,b)。综上所述,这些结果表明SLG1在水稻耐热性中发挥正调控作用。
 

在酵母中,CTU2似乎通过与CTU1形成功能复合物而催化tRNA硫醇化过程的最后一步。在水稻中鉴定出LOC_Os02g52470和LOC_Os01g41565的两种同源蛋白。LOC_Os02g52470与ROL5 / AtCTU1具有很高的序列相似性,因此标注为水稻CTU1蛋白(RCTU1)。为了研究RCTU1是否与SLG1在相同的作用途径,分别在WT(SLG1RCTU1-RNAi)和slg1(slg1RCTU1-RNAi)背景下构建了RCTU1-RNAi转基因植物,发现SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi转基因植物均表现出与slg1类似的表型,包括增加的籽粒长度,细长的植物结构和有缺陷的根系。此外,类似于SLG1,RCTU1的转录也被高温高度诱导(图1d),并且SLG1RCTU1-RNAi和slg1RCTU1-RNAi幼苗的存活率在高温下均大大降低(图1h)。这些结果表明,RCTU1-SLG1复合物在水稻耐热性中起重要作用。
 

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图1 | SLG1在水稻耐热性中发挥正调控作用

(a,b) slg1,WT和slg1-C,SLG1-RNAi和SLG1-OE的T2转基因植株表型和粒形;

(c)SLG1基因的精细定位;

(d)SLG1和RCTU1在高温诱导下的表达;

(e–g) SLG1是耐热性的正调控因子;

(h) RCTU1-RNAi显示出与slg1突变体相似的表型;


2、SLG1介导的耐热性与硫醇化tRNA水平呈正相关
 

CTU1–CTU2复合物负责胞质tRNA的2-硫醇化,硫醇化的损失导致了酵母菌株中的热敏表型的丧失。本研究发现slg1中的硫醇化tRNA数量远低于WT,这表明SLG1的功能丧失会破坏突变体中的tRNA硫醇化。SLG1的功能异常会影响tKUUU,tEUUC和tQUUG的硫醇化水平(图2b)。
 

通过比较正常和高温条件下的硫醇化tRNA水平来分析高温对tRNA硫醇化的影响。升温影响水稻中U34的硫醇化并导致tRNA的低硫醇化(图2c)。在高温下,WT中的tRNA硫醇化水平比slg1高得多(图2d),这与WT的较高存活率相符(图1e)。随着WT,SLG1RCTU1 RNAi,slg1和slg1RCTU1-RNAi中tRNA硫醇化水平的降低(图2e),植物的存活率分别降低至90%,36.5%,15.2%和5%(图2e)。相反,与WT相比,具有更高tRNA硫醇化水平的SLG1-OE植物具有更高的耐热性(图1g,2f)。综上所述,SLG1介导的耐热性与tRNA硫醇化水平呈正相关。

 

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图2 | SLG1介导的耐热性与tRNA硫醇化水平呈正相关

(a)slg1和WT之间tRNA硫醇化水平的比较;

(b) Northern印迹分析,使用tKUUU,tEUUC和tQUUG的3种tRNA异构体来检测特异的硫醇化tRNA;

(c) tRNA硫醇化过程受到高温胁迫的不利影响。NC,正常情况;HC,高温(45°C,44 h; g)条件下。

(d–f) tRNA硫醇化水平的比较;


此外,本文运用iTRAQ蛋白质组学探索了tRNA硫醇化对蛋白质的影响,鉴定到1610个蛋白,其中112个为差异蛋白(FC1.2)。发现SLG1的功能障碍会影响蛋白质的积累,尤其是涉及翻译,代谢和应激反应的蛋白质的积累蛋白质组学分析也揭示了slg1突变体中五种蛋白质(TrEMBL UniProt ID:Q6ZFJ9,Q651B0,Q653F6,Q6Z2M2和Q9LWT6)的积累,这些蛋白质与unfolded protein binding and chaperone-mediated protein folding有关。此外,发现该突变体中异常合成了一些氧化应激相关蛋白,例如TrEMBL UniProt ID Q0E4K1,Q0DTX5,P93407和Q6L4W7,这可能是由于未折叠的蛋白应答与活性氧(ROS)信号。因此,植物中的tRNA硫醇化状态似乎与ROS稳态密切相关,这可能对携带SLG1Ind的植物耐受高温胁迫有利。
 

3. SLG1的分化分析
 

使用4219个水稻种质进一步分析了SLG1的自然变异,并在SLG1的启动子和编码区分别发现了10个和7个SNP(图3a)。在编码区的七个SNP中,T865C和G1839T的两个核苷酸取代分别引起氨基酸从Val177到Ala177的转化以及从Val362到Phe362的氨基酸转化,而其他五个是同义取代(图3a)。
 

在栽培稻中发现了两个氨基酸突变,其中9稻中有Val8.2-Val362的9稻占98.2%,粳稻中Ala177-Phe362的粳稻占99.1%,表明它们对SLG1的功能分化有贡献。基于多态性,可将4219个种质分为5个单倍型(图3b),其中767个(96.1%)温带粳稻种中的737携带Hap1,而2691个(93.9%)in稻种中的2527个携带Hap2。值得注意的是,几乎所有的aus种质(98.9%)都可以明确地分类为Hap4。热带粳稻(Trj)组有两个主要的单倍型,Hap3(73.9%)和Hap1(25.5%),它们在启动子区域中只有一个核苷酸(A252C)不同。Hap5仅在the虫组中以极低的频率(约0.8%)发现,与Hap2高度相似,除了启动子区域的单个核苷酸差异(G432A)。
 

除了野生稻种之间SLG1基因组区域的大量变异外,野生稻种中SLG1单倍型的数量与Ind,Tej,Trj和Aus的完全相同。例如,in稻品种93-11的SLG1等位基因与野生稻登录号W1687(Hap2)相同;澳洲品种Kasalath与W593(Hap4)具有相同的单倍型;温带粳稻品种Nipponbare携带与W3078(Hap1)相同的SLG1等位基因,而热带粳稻品种NERICA3与W120(Hap3)具有相同的等位基因。这些结果表明,SLG1Tej,SLG1Trj,SLG1Ind和SLG1Aus可能代表了保存在不同麦冬野生稻种中的古老等位基因,并且可能在水稻驯化的早期进行了阳性选择。
 

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图3 | SLG1在亚洲栽培稻中的分化

(a)对来自4219个亚洲栽培稻种的SLG1启动子和编码区的单倍型分析;

(b)五种SLG1单倍型在亚洲不同栽培稻品种中的分布频率。


4. SLG1Ind表现出很强的耐热性
 

推测SLG1差异可能是两个亚种(indica和japonica)耐受不同环境温度的决定性因素。通过将SLG1(SLG1Ind)的等位基因引入KY131(SLG1Tej)来构建近等基因系(NIL)(图4a)。在正常生长条件下,获得的NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej植物在苗期表现出与其相应受体相同的外观(图4b)。当遇到高温胁迫时,NILSLG1Tej幼苗的存活率(50%)要比indica受体ZF802的存活率(93%)低得多(图4b)。相反,NIL-SLG1Ind幼苗的耐热性相对于KY131显著提高,NIL-SLG1Ind的平均成活率约为81%,而KY131的平均成活率约为48%(图4b),表明SLG1Ind优于SLG1Tej在植物中耐受高温胁迫。

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图4 | SLG1Ind比SLG1Tej具有更高的耐热性

(a)NIL-SLG1Ind和NIL-SLG1Tej的染色体图。红色矩形表示包含SLG1基因座的供体片段。NIL-SLG1Ind表示带有来自ZF802(indica)的SLG1Ind等位基因的KY131(温带粳稻),NIL-SLG1Tej表示带有来自KY131的SLG1Tej等位基因的ZF802;

(b)SLG1Ind和SLG1Tej等位基因之间的耐热性比较;
 

为了进一步评估SLG1Ind和SLG1Tej之间的功能差异,通过转基因方法扩增了KY131和93-11中SLG1的启动子和基因序列,并将它们引入slg1中以生成互补植物JPJC(带有Tej-的Tej型启动子)。IPIC(具有Ind型基因序列的Ind型启动子)品系显示出比JPJC更高的耐热性,在IPIC中的平均存活率约为69%,而在JPJC中约为29%(图5a,b)。
 

为了了解tRNA硫醇化在SLG1Ind和SLG1Tej的耐热性差异中的作用,对IPIC和JPJC植物中的硫醇化tRNA进行了定量分析。slg1中的tRNA硫醇化水平比野生型显著降低(图5c),并且SLG1Ind或SLG1Tej的引入挽救了突变体的硫醇化缺陷(图5c)。这些结果表明SLG1介导的tRNA硫醇化是SLG1Ind和SLG1Tej之间耐热性差异的原因。
 

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图5 | SLG1Ind互补植物显示出很强的耐热性和高tRNA硫醇化水平

(a,b) IPIC,IPJC,JPIC和JPJC之间的耐热性比较;

(c,d)基于LC/MS-QQQ(c)和APM(d)方法检测slg1,WT,IPIC和JPJC转基因品系中的tRNA硫醇化水平;


5. SLG1Ind可提高水稻孕穗期的耐热性
 

水稻植物对高温胁迫高度敏感,尤其是在孕穗期,因此提高生殖阶段的耐热性对于减少产量损失尤为重要。对成年植物slg1和WT进行了高温处理,以评估SLG1在孕穗期的作用。发现slg1的结实率低于28%,而WT的结实率在40°C处理5天后可达到72%(图6a,b)。这些结果表明,SLG1在生殖阶段的耐热性中起重要作用。
 

在我们的NIL品系中,我们观察到NILSLG1Ind植物的育性降低,这很可能是由于SLG1与杂种不育基因HSA145的紧密联系所致。为了进一步探讨SLG1在生殖阶段的可能作用,我们从IPIC,IPJC,JPIC和JPJC构建体中分别选择了8条独立系,其中一半经高温处理5天,另一半经7天处理。IPIC显示出最高的结实率,在高温处理5天和7天后分别达到约81%和49%(图6c,d);相反,JPJC的结实率分别仅为约47%和22%(图6c,d)。处理5天和7天后IPJC系的结实率分别约为68%和43%,而JPIC系的结实率分别约为63%和37%(图6c,d)。这些结果进一步表明,SLG1Ind的启动子和编码序列上的变异都有助于水稻的耐热性。
 

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图6 | SLG1Ind可以提高孕穗期的耐热性

(a,b)slg1突变体在孕穗期对高温高度敏感;

(c,d) IPIC,IPJC,JPIC和JPJC之间的耐热性比较;


研究结论
 

SLG1编码一个保守的细胞质tRNA 2-硫化蛋白2 (RCTU2),它的功能缺陷会导致水稻体内的tRNA硫醇化水平缺陷,伴随着明显的高温敏感表型;而过表达SLG1则能够显著提高水稻对高温耐受性。通过对栽培稻序列分析发现,SLG1在品种中存在单倍型分化,其中96.1%的温带粳稻属于一种单倍型,而93.9%的籼稻则属于另外一种单倍型,暗示SLG1可能是一籼粳稻分化基因,核酸序列多态性分析也表明SLG1是一个显著的驯化选择位点。携带籼型SLG1的水稻植株对孕穗期高温也具有更强的抵抗能力。

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图7 | 驯化期间SLG1等位基因的选择模型

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SLG1能够与水稻中细胞质tRNA 2-硫化蛋白1(RCTU1)互作,RCTU1功能缺陷也导致水稻tRNA硫醇化水平降低和高温敏感表型。水稻的高温耐受性和tRNA硫醇化水平呈正相关。通过对4219个栽培稻序列分析发现,SLG1在品种中存在单倍型分化,其中96.1%的温带粳稻属于一种单倍型,而93.9%的籼稻属于另一种单倍型,暗示SLG1可能是一籼粳稻分化基因,核酸序列多态性分析也表明SLG1是一个显著的驯化选择位点。通过对近等基因系及转基因植株的高温处理试验表明,携带籼型SLG1的水稻植株比携带粳型SLG1水稻植株具有更强的高温耐受能力,且与tRNA硫醇化水平呈正相关。通过启动子和编码区互换不同转基因材料热处理实验显示,SLG1启动子区和编码区的序列差异共同决定籼型和粳型SLG1耐热性差异。同时,携带籼型SLG1的水稻植株对孕穗期高温也有更强的抵抗能力。因此,该研究证明tRNA硫醇化修饰在水稻响应高温胁迫中的重要功能,并为应对全球变暖、设计培育高温胁迫耐受性水稻品种提供有效策略。

 


 

参考文献:

Xu Y, Zhang L, Ou S, Wang R, Wang Y, Chu C, Yao S. Natural variations of SLG1 confer high-temperature tolerance in indica rice. Nat Commun. 2020 Oct 28;11(1):5441. doi: 10.1038/s41467-020-19320-9. PMID: 33116138.
 

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文章来源于鹿明生物

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