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医学研究:临床SCI研究FFPE、微量样本等临床蛋白质组学研究 

 

小鹿:我有一批流式分选的细胞,没法达到常规1×10^7的细胞量要求,但我要做蛋白质组,怎么办?

小鹿:我要做转基因小鼠的角膜组织,样本太珍贵了,没有足够的经费去养小鼠混样,从而达到常规100mg的量,我要做蛋白质组,怎么办?

小鹿:我做的疾病研究太难收集新鲜样本了,都收集了半年了,一组的组织样本才收集了几例,怎么办,病理科倒是有很多这个疾病的FFPE样本,能不能拿到做蛋白质组啊?......

其实有一个成熟的技术已经可以为大家解决上面的问题。这个技术叫做PCT-DIA
 

PCT-DIA是什么?
 

PCT-DIA技术是一种针对特殊样本的蛋白质组学技术。

主要针对的样本为:微量细胞样本、微量新鲜组织、石蜡穿刺样本、活体穿刺样本、石蜡切片样本、甲醛固定切片等。

PCT技术可将微量的珍贵样品中的蛋白质释放出来,从而获得足够质谱检测的肽段量。不仅可以最大限度地减少样品的处理,而且可使样品损失最小化。

DIA技术无通量限制,可用于大规模样本的蛋白鉴定,且数据覆盖度高、重复性好、稳定性好。

将这两种技术强强结合,可实现针对石蜡样品、甲醛处理样本、冰冻切片、活检样本等特殊样本或者微量样本的蛋白组学分析,运用其通量高、稳定性强、速度快和精度高的特点,可解决特殊样本或者微量样品难以进行蛋白质组的技术难题。
 

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图1 | PCT-DIA技术蛋白质组实验流程


PCT-DIA蛋白鉴定数量?
 

利用PCT-DIA鉴定的FFPE样本、微量细胞或者微量组织的蛋白鉴定数量可达到3000-6000个。
 

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PCT-DIA文献推荐
 

// 文献一

Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps

研究内容:

2015年发表在Nature Medicine(IF= 36.13),利用PCT-DIA技术对新鲜穿刺组织和微量细胞样本进行蛋白质组鉴定:(1)获得优质的蛋白质定性和定量数据;(2)大样本数量的新鲜穿刺组织获得蛋白质组数据,可进行分子分型。
 

// 文献二

High-throughput proteomic analysis of FFPE tissue samples facilitates tumor stratification

研究内容:

2019年发表在Molecular Oncology(IF=6.574),利用PCT-DIA技术对脱蜡后的FFPE和冰冻样本进行蛋白质组鉴定:(1)FFPE样本和冰冻样本蛋白质组表达模式相似;(2)1-15年FFPE样本中的蛋白质组表达模式稳定;(3)FFPE样本中获得的蛋白质可用来筛选潜在生物标志物。
 

// 文献三

Protein Classifier for Thyroid Nodules Learned from Rapidly Acquired Proteotypes

研究内容:

2020年发表在medRxiv上,利用PCT-DIA技术对大样本数量的FFPE样本和活检穿刺样本进行蛋白质组研究,筛选出甲状腺结节诊断的潜在生物标志物。

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PCT-DIA技术详解
 

// 1.PCT样品前处理技术介绍
 

a.什么是PCT技术
 

PCT是一种针对特殊样品的蛋白质前处理技术,利用Barocycle仪器(高低压循环破碎仪)通过在超高压和环境压力之间程序性、周期性变换,使样品中蛋白质释放,促进并加速蛋白质酶解。PCT技术具有速度快、损失操作简便、保真度高等特点。

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图2 | Barocycle仪器示意图


b.PCT技术的优势及应用
 

可处理样本:石蜡包埋样本、甲醛固定样本、临床活检样本、微量细胞样本、花粉/鱼苗等。
 

肽段得率高、获得量稳定:

106的U2OS细胞(n=10)可获得平均总肽段量为116ug,CV=4.9%;1mg小鼠肝脏组织(n=4)可获得平均总肽段量50ug,CV=7.9%;1mg人肾脏组织(n=12,正常组织 vs 肿瘤组织)可获得平均总肽段量50ug,CV=40.7%(人样本个体差异较大,且肿瘤组织之间获得的肽段量变异系数偏大,因此对于人体样本,建议扩大生物学重复)(图1a)。获得的总肽段量比传统方法高20%(图1b)。总肽段量满足质谱检测的需求。
 

操作步骤少:比传统样本处理方法减少近10个步骤,且可最多96个样本同时前处理,减少了样本前处理的误差。
 

操作误差小:PCT技术通过Barocycle仪器(高低压循环破碎仪)精确控制,有效地减少了人为操作误差。
 

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图3 | PCT辅助组织裂解和蛋白质酶解的肽段得量和效率

(a)PCT技术对U2OS细胞、小鼠肝脏组织和人肾脏组织通过组织裂解、蛋白质提取及酶解后获得的肽段量和变异系数图;(b)用小鼠肝组织比较PCT技术和传统方法的酶解效率。PCT技术比传统方法获得的肽段数量高

10%-20%。

参考文献:

Rapid mass spectrometric conversion of tissue biopsy samples into permanent quantitative digital proteome maps. Nat Med. 2015 Apr;21(4):407-13.

 

//2.DIA质谱扫描技术介绍
 

a.什么是DIA质谱扫描技术
 

到目前为止,蛋白质组学分析主要采用数据依赖采集(data dependent acquisition,DDA)和数据非依赖采集(data independent acquisition,DIA)两种质谱扫描模式。

DDA选择一级质谱中相对高峰度离子进行高能碰撞碎裂,产生的碎片离子送入二级质谱检测(图2A)。因此DDA扫描方式获得的数据覆盖率低、重复性低、稳定性低。

DIA将质谱整个全扫描范围分为若干个窗口,高速、循环地对每个窗口中的所有离子进行选择、碎裂及检测,从而无遗漏、无差异地获得样本中所有离子的全部碎片信息(图2B)。因此DIA扫描方式获得的数据覆盖率高、重复性高、稳定性高。
 

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图4 | DDA与DIA质谱扫描原理图

(a)DDA质谱扫描原理为每个扫描周期内,只采集丰度最高的10-20个母离子信号及对应的子离子碎片信息,其余母离子信息及子离子信息丢失。(b)每个扫描周期内,将质量区间设置为多个区段窗口,每次采集窗口内所有母离子及对应的子离子信号。


b.DIA比DDA获得的数据更稳定、更准确
 

在定量准确性和重复性上都要优于DDA模式(图3),且能够定量到更多的低丰度蛋白。DIA也正是因为这种全扫描方式,导致DIA模式产生的碎片离子谱图过于复杂,难以通过与目前数据库中理论图谱直接匹配的方式得到蛋白定性的结果。因此目前常用的解决方法是利用DDA扫描模式建立样本的参考库,对DIA的数据进行分析来做定性和定量。
 

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图5 | DIA比DDA扫描获得的数据更稳定、更准确

(c)DIA定量准确性、线性范围接近靶向定量技术MRM/PRM水平;(d)DDA:CV<10%的数据~25%,CV<20%的数据~59%;DIA:CV<10%的数据~69%,CV<20%的数据~90%.


参考文献:

Gillet, L. C. et al. Targeted data extraction of the MS/MS spectra generated by data-independent acquisition: a new concept for consistent and accurate proteome analysis. Mol. Cell. Proteom. 11, O111.016717 (2012)
 

c.DIA蛋白鉴定数量和分级与iTRAQ可媲美
 

iTRAQ为传统的标记定量蛋白质组技术,文献多,技术稳定。DIA在无需经过低PH液相预分组份的情况下,可以与iTRAQ预分6个组份后鉴定到的蛋白质数量相近,且DIA能够定量到更多的低丰度蛋白质(图4)。

DIA技术与依赖于试剂盒的iTRAQ/TMT不同,DIA技术无通量限制,大队列的样本也可进行蛋白质谱鉴定。
 

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图6 | DIA与预分6个组份的iTRAQ鉴定到的蛋白质数量相近,且DIA能够定量到更多的低丰度蛋白质.


参考文献:

Trayambak Basak,Ajay Bhat,et al。In-depth comparative proteomic analysis of yeast proteome using iTRAQ and SWATH based MS. Mol. BioSyst., 2015,11, 2135


技术应用拓展
 

PCT技术为特殊样本/微量样本前处理技术,可与DIA、TMT和PRM技术联用:

1、样本数量>16个,采用PCT-DIA技术,需要利用混样建立DDA本地数据库。

2、样本数量≤16个,采用PCT-TMT技术,无需建立数据库,但有样本数量限制。

3、靶向蛋白验证,采用PCT-PRM技术,无需抗体,一次对一个样本中20-40个蛋白进行靶向验证。

通常利用PCT-DIA技术进行普筛,获得目标蛋白后,利用PCT-PRM技术进行目标蛋白验证。


样本指南
 

PCT-DIA样本指南:
 

常规蛋白质技术,如建议的细胞量为≥1×10^7 个;动物组织量为100mg;植物组织量为500mg。而PCT-DIA技术所需量远低于常规量,具体如下:
 

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以上样本,都请做1-2个备份并寄送。
 

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文章来源于鹿明生物

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