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Autophagy项目文章 | 上海交通大学医学院运用IncRNA、iTRAQ研究诱导自噬抑制葡萄膜黑色素瘤的发生机理

前言
 

葡萄膜恶性黑色素瘤是成年人中最多见的一种恶性眼内肿瘤,在国外其发病率占眼内肿瘤的首位,在国内则仅次于视网膜母细胞瘤,居眼内肿瘤的第二位。此瘤的恶性程度高,眼后是好发部位。易经血流转移,85%转移至肝脏。本篇由欧易/鹿明生物合作客户上海交通大学医学院范先群教授课题组发表在《Autophagy》的”ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression“运用欧易/鹿明生物lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术探究lncRNA 在 UM 肿瘤发生中的作用报道。
 

基本信息
 

论文题目:ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression

发表期刊:Autophagy

影响因子:11.059

上海交通大学医学院李鹏、何杰、阳志为共同第一作者,上海交通大学医学院范先群教授、钟清研究员和同济大学张赫教授为共同通讯作者

文章中 lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术由欧易/鹿明生物提供服务。

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研究背景
 

lncRNA 在多种肿瘤发生、发展中发挥重要作用。葡萄膜黑色素瘤(Uveal Melanoma ,UM)是成人最常见的眼内恶性原发性肿瘤,恶性程度高,大约 50% 的原发性 UM 患者最终会发生远端转移,死亡率高。目前,lncRNA 在 UM 肿瘤发生中的作用报道较少。
 

研究内容
 

本研究通过在 UM 细胞中使用 MTOR 抑制剂后进行 lncRNA 芯片筛选,发现一个显著上调的 lncRNA ZNNT1。过表达 ZNNT1 可以上调 ATG12 的表达,促进细胞自噬,抑制 UM 肿瘤发生和转移的能力。而 knockdown ZNNT1 可以抑制细胞自噬。体内实验表明,ZNNT1 可以抑制裸鼠黑色素瘤的生长。Knockdown ATG12 可以部分缓解 ZNNT1 引起的肿瘤抑制作用。以上研究表明,lncRNAZNNT1 通过 ATG12 促进细胞自噬,在葡萄膜黑色素瘤中发挥抑癌基因作用。


研究线路
 

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研究结果
 

1. lncRNA ZNNT1 是 MTOR 的下游分子

为研究葡萄膜黑色素瘤中细胞自噬的作用,使用 MTOR 抑制剂雷帕霉素和 PP242 对 UM 细胞进行处理,结果显示 MTOR 抑制剂促进了 UM 细胞自噬。通过lncRNA 芯片对处理前后的细胞进行筛选,共有 42 个lncRNA 表达量发生了显著改变(下图 C),RT-PCR 验证显示 lncRNA n341569 发生了显著上调(下图 D, E)。通过 RACE 实验克隆了该 lncRNA 的全长,命名为 ZNNT1。

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图 1 |lncRNA ZNNT1 是细胞自噬相关的 lncRNA

C: lncRNA 芯片结果;D, E: RT-PCR 结果;F: ZNNT1 基因结构


2. ZNNT1 调控 ATG12 的表达
 

细胞亚定位显示 ZNNT1 主要位于细胞核内。为研究 ZNNT1 的作用机制,在 UM 细胞中过表达 ZNNT1 后,利用定量蛋白组技术 iTRAQ 检测显示共有 231 个蛋白质表达发生了显著改变,其中 ATG12 表达量上调近 2 倍(下图 C, D),RT-PCR 也显示 ATG12 在 mRNA 水平也发生上调(下图 E)。ATG12 是一个泛素样蛋白,与 ATG5 结合促进 LC3/Atg8 的脂化并指导其在自噬体上的定位。
 

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图 2 |lncRNA ZNNT1 促进 ATG12 表达

C: iTRAQ 结果;D: ATG12 蛋白的表达水平;E: ATG12 mRNA 的表达水平


3. ZNNT1 促进细胞自噬
 

WB 实验显示过表达 ZNNT1 会促进用 LC3-I 转化为 LC3-II,以及 SQSTM1 的降解,这些指标表明细胞自噬现象的发生。同时,将 ATG5 knocking down 之后,可以中和 ZNNT1 过表达所引起的自噬反应。
 

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图 3 |lncRNA ZNNT1 促进细胞自噬

A, B: ZNNT1 过表达后,细胞自噬相关蛋白的表达;D: ZNNT1 过表达同时敲低 ATG5 表达后,细胞自噬相关蛋白的表达


4. ZNNT1 抑制 UM 细胞的肿瘤发生和转移能力
 

过表达 ZNNT1 可以抑制 UM 肿瘤细胞的生长(下图 A, B)、促进细胞死亡(下图 C)。transwell 实验也显示 ZNNT1 的过表达可以抑制 UM 细胞的迁移能力(下图 D)。

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图 4 |lncRNA ZNNT1 抑制 UM 肿瘤发生和转移


5. ZNNT1 缺失可以中和 UM 细胞自噬
 

在 UM 细胞中 knockdown ZNNT1,可以显著抑制 PP242 和雷帕霉素引发的细胞自噬,降低 LC3-I 向 LC3-II 的转化和 SQSTM1 的降解。

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图 5 |lncRNA ZNNT1 敲低抑制细胞自噬
 

6. ZNNT1 在体内抑制肿瘤生长
 

与对照相比,在裸鼠体内过表达 ZNNT1 可以减缓肿瘤的生长。而在临床黑色素瘤组织样品中,ZNNT1 的表达水平显著低于正常组织。

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图 6 |lncRNA ZNNT1 抑制肿瘤生长


7. ATG12 敲低可以部分抑制 ZNNT1 介导的肿瘤抑制作用
 

在 ZNNT1 过表达的 UM 细胞中,同时 knockdown ATG12,结果显示 LC3-I 向 LC3-II 转化、SQSTM1 降解减少,促进肿瘤细胞增殖和转移。


研究结论
 

本研究表明,在葡萄膜黑色素瘤中,lncRNA ZNNT1 起到了抑癌基因作用。ZNNT1 可以通过上调 ATG12 表达,调控 ATG12-ATG5 结合,促进细胞自噬,进而抑制了肿瘤的发生。本研究通过运用lncRNA 芯片、iTRAQ 蛋白质定量技术为葡萄膜黑色素瘤的临床治疗提供了新的思路。
 

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参考文献

Li P, He J, Yang Z, et al. ZNNT1 long noncoding RNA induces autophagy to inhibit tumorigenesis of uveal melanoma by regulating key autophagy gene expression. Autophagy 2019; doi: 10.1080/15548627.2019.1659614.

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文章来源于鹿明生物

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