组学干货

Nat Genet |(IF:27.6)LC-MS非靶向代谢组学和转录组联合分析揭示野生番茄果实成熟代谢及抗病性的遗传框架

前言

 

2020年9月,以色列魏茨曼研究所Asaph Aharoni教授团队和德国莱布尼茨植物遗传学和作物植物研究所(IPK)Nature Genetics期刊发表的题为 “Analysis of wild tomato introgression lines elucidates the genetic basis of transcriptome and metabolome variation underlying fruit traits and pathogen response”的研究成果,该研究以秘鲁野生番茄品种(LA0716或PI246502)和现代栽培番茄品种M82构建的遗传群体为研究对象,运用转录组学+LC-MS非靶向代谢组学确定了与数百种转录物和代谢物水平相关的基因组位点,对促进类黄酮在果实果皮组织中积累的相关位点和基因进行了分析,为理解番茄果实成熟过程中的代谢和病原菌抗性提供了遗传框架,并为研究关键果实品质性状提供了依据。
 

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中文标题:利用野生番茄渐渗系阐明转录组和代谢组变异对果实性状和病原菌响应的遗传基础的潜在影响

研究对象:番茄的果实和果皮

发表期刊:Nature Genetics

影响因子:27.603

发表时间:2020年9月28日

运用生物技术:LC-MS非靶代谢组学+转录组学
 

研究背景
 

为满足市场和经济需求,经过人类千百年的驯化和育种后,番茄的表型和味道都有了显著的改良。但是育种的连续选择导致遗传多样性降低,一些优良的果实性状,包括质地、营养、香气和风味物质等随之丧失,甚至还包括果实对各种病原体的抵抗力。而野生番茄种代表了大量在驯化过程中丢失的理想性状的丰富基因库。因此,近年来研究人员和育种者致力于使用野生番茄亲缘种寻找将这些性状重新引入商业品种所需的遗传库。但就目前来看,需要更先进的群体定位和更深入的多组学表型来识别导致复杂性状的遗传线索。
 

研究方法
 

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研究结果
 

1、580个渐渗系的番茄多组学数据资源获取及分析
 

作者通过使用高分辨率质谱的非靶向代谢组学RNA测序相结合的方法,分析了580个渗入系(504个BILs和76个ILs)在两个果实发育阶段,即破色阶段(开花后约44天)和红熟阶段(开花后约48天)的果皮组织(图1a)中代谢物的组成和基因表达,并利用灰霉病菌对红果期番茄果实的进行病原体敏感性分析及定量分析。线性模型表明转录物、代谢物和灰霉病菌感染后的抗性评分与特定作图区的渐渗发生有统计学关联(概率对数的显著性阈值(LOD)≥5,FC≥2;图1c)。这些QTL用于推断基因-转录物-代谢物-病原体敏感性相互作用(图1d)。
 

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图1 | 野生番茄物种渗入的多模态研究


2、通过表达QTL分析揭示果实发育过程中的基因调控相互作用及S.pennellii渐渗导致与成熟过程相关的基因表达变化
 

群体的转录组学揭示了S. pennellii渗入的存在和特定基因的表达之间的显著联系(图2a)。共检测到582个转录本具有显著的顺式转录因子,496个转录本显示至少一个显著的反式转录因子。基于LOD值的eQTL在顺式和反式位置分别产生总共2,202和1,692个eQTL。
 

研究表明,响应S. pennellii基因渗入而上调的转录本库显著富集于次生代谢、光合作用、纤维素合成、角质层形成、脂肪酸生物合成、细胞分裂素、油菜素内酯信号转导和生物胁迫反应中,而由于基因渐渗而下调的基因与淀粉合成、成熟调节和苯丙氨酸代谢等有关(图2a)。FUL1的4个靶基因(肉桂酰-辅酶a还原酶、羟基肉桂酰转移酶和果胶酸裂解酶同源物)存在差异表达(图2b),可能是包括FUL1基因本身在内的FUL1基因座的基因融合导致它们的表达下调。FUL2基因座及其靶基因也存在类似的模式。虽然RIN基因的渗入没有引起eQTL热点的出现,但RIN激活的两个基因(ACC合酶4(ACS4)和一个假定的反应性蛋白酶抑制剂1(ER1))映射到了RIN位点(图2c)。相关分析进一步支持了S. pennellii基因渗入对RIN、FUL1和FUL2基因座的差异影响。
 

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图2 | 在整个渐渗系群体中的eQTLs分析
 

3. 代谢组学确定了果实成熟过程中次级代谢的酶促瓶颈
 

利用液相色谱-高分辨率四极杆飞行时间质谱联用(LC-qTOF-MS)对破色阶段和红熟阶段的果皮组织进行代谢组学分析。分析结果显示,在两个不同阶段的样品中分别检测出526和1019种半亲脂性代谢物。从eQTLs观察,热点(hotspot)中出现多种代谢物的mQTLs(图3)。这些观察结果强调了遗传关联随果实发育到成熟阶段的代谢过渡而发生变化的时间动态。所观察到的mQTL常与关键调控或酶促基因位点相关。
 

Bin 424的mQTL是代谢变化最大的hotspot区域,共有249个代谢物差异积累。其中至少22种黄酮类化合物在红果期显著下调,芦丁和4种酚苷上调。在果实发育破碎期芦丁和酚苷类含量也有明显的上调,表明该基因座(CHI1)在果实发育和成熟过程中具有持续作用。而CHI1的表达被认为是番茄果实成熟过程中类黄酮生物合成的瓶颈。
 

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图3 | 整个渐渗系群体中代谢QTL的定位


4. 果实成熟过程中防御型甾族糖苷生物碱(SGA)成分的化学变化
 

在番茄中,苦涩的α-蕃茄碱是叶片和绿色果实中主要的甾族糖苷生物碱(SGA)。α-番茄碱在番茄从绿色果实向红色果实的转变过程中转化为苦参糖苷A及其衍生物(图4a)。我们的多基因位点数据强调了与α-番茄碱及其下游衍生物变化相关的多个位点(图4b),数据指出了成熟过程中产生SGAs的生物合成途径中关键酶的功能,包括可催化α-番茄碱羟基化的糖生物碱代谢31(GAME31),以及一个介导乙酰氧基-羟基番茄碱形成七叶皂苷的尿苷二磷酸糖基转移酶家族成员(GAME5)。
 

在GAME31基因的基因组区域(bin 87;2号染色体)中,S. pennellii渗入会导致羟基番茄碱的增加,以及α-番茄碱水平的相应降低(图4b)。为了测定QTL是否源自改变的GAME31表达或S. lycopersicum和S. pennellii变异体的酶活性,我们用重组S. pennellii GAME31酶进行了活性分析。酶活性测定表明,QTL定位中SGA水平的变化可能是GAME31基因表达(可能在启动子区)变化的结果。
 

在番茄果实成熟过程中,乙酰氧基-羟基番茄碱被糖基化形成七叶皂苷A(图4a)。在Bin 1,006注释的总共30个基因中,我们检测到三种推定的UDP糖基转移酶,其中只有GAME5在破色阶段和橙色阶段之间表现出高度上调。基于VIGS分析的结果,红色成熟果实中基因GAME5的沉默导致七叶皂苷A减少,乙酰氧基-羟基番茄碱(七叶皂苷A前体)的水平显著增加(图4d)。这表明GAME5参与了乙酰氧基-羟基番茄碱向七叶皂苷A的转化。作者在大肠杆菌中表达GAME5以确定糖基转移酶活性,并用乙酰氧基-羟基番茄碱和UDP-葡萄糖进行重组酶分析。该实验结果为七叶皂苷A的形成,以及为GAME5作为乙酰氧基-羟基番茄碱UDP-葡糖基转移酶的活性提供了强有力的证据(图4e)。
 

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图4 | 在番茄果实成熟过程中介导化学物质向成熟相关SGAs转移的酶


5. 成熟果实对灰霉病敏感性的遗传关联
 

通过在真菌接种红色成熟阶段的果实后测量病变区域的直径,对整个BIL和IL集合对灰葡萄孢的敏感性进行评分,番茄灰霉病抗性评分(BRS)通过每个定位bin对灰霉病感染的影响来描述。与抗性增加相关的QTL包括6号染色体上bin 542(跨越88个带注释的基因)的基因组区域和9号染色体上bin 820和bin 862之间的较大区域之间,在bin 827和bin 859有两个显著最大值(包括另外289个带注释的基因)。相反,与灰霉病菌感染的敏感性增加相关的两个QTL分别在bin 18和19区域中包含1,669个带注释的基因,在bin 23和24区域中包含58个基因。
 

6. 整合全种群真菌抗性数据可确定果实病原体关联的要素
 

作者应用转录组学+代谢组学的多组学联合分析方法预测了BILs和ILs对灰霉病菌感染的抗性,并使用正则化回归分析估计了每个数据集对预测灰霉病抗性的总贡献(图5a)。结果表明转录组数据是灰霉病菌抗性的主要预测因子(预测贡献约33%;图5b),接着是红熟期的代谢物水平(~7%)。破色期的代谢物水平以及渐渗图谱数据在一定程度上有所贡献(分别约为5%和3%)。
 

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图5 | 从多组学数据预测灰霉病抗性
 

作者进一步使用加权相关分析,构建了一个转录物和代谢物的网络,这些转录物和代谢物共享显著的QTL,并表现出与BRS相关的变化(图6a)。候选转录物和代谢物形成了两个紧密共表达的网络群落。真菌抗性相关群落包括110个转录本,其中包括番茄主要的类黄酮柚皮苷查尔酮和两种类黄酮苷(3′,5′-di-C-glucosylphloretin 和phloretin-trihexose)。灰霉病菌易感性相关网络群落包括99个转录物和7个代谢物,其中一个被注释为3,4-二羟基苯甲酰基-d-吡喃木糖苷。
 

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图6 | 网络分析揭示灰霉病菌抗性相关基因和代谢产物
 

7. 泛酸在番茄果皮中的积累促进了对番茄灰霉病菌的抗性
 

在真菌抗性相关网络群落中发现的六种代谢物代表了灰霉病菌抗性机制的潜在新元素。通过LC–qTOF–MS对果实提取物进行检测分析后,发现泛酸(维生素B5;图6a)可作为一种抗真菌候选代谢物。使用不同浓度的泛酸进行感染抑制试验,从而验证了其对灰霉病菌生长的影响,显示在10 M和100 M泛酸浓度下真菌生长分别减少了10-40%。
 

8. 选定候选基因的沉默导致对灰霉病菌的易感性增加
 

为了进一步表征抗性和易感性相关基因,作者分析了果实组织和发育阶段特异性表达,以及成熟抑制剂(rin)和非成熟(nor)成熟突变体中以及用信号抑制剂1-甲基环丙烯(MCP)处理后的表达变化(图7),结果显示存在四个主要的基因表达簇。聚类分析表明,属于抗性子网络的转录本主要在绿色果实的果皮和果肉组织中都有表达,在非成熟突变体果实中表达上调。然而,大多数易感性相关的子网基因是成熟簇的一部分,在橙色和红色成熟阶段上调,在rin和nor突变体中主要下调。
 

另外,作者选择了三个潜在的抗性候选基因(ACO5,ACD2和4CL-Like)进行基因沉默,同时监测ACO5,ACD2和4CL-Like基因的相对转录水平。真菌接种离体果实后3 d,pTRV:ChlH:ACO5,pTRV:ChlH:ACD2和pTRV:ChlH:4CL-Like果实的坏死病灶分别增加了42.8%,36.2和47.4%(与对照组相比)。结果表明,通过网络分析确定的三个基因可能是成熟番茄果实中真菌抗性所必需的。
 

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图7 | 灰霉病抗性相关基因的基因表达模式


相关讨论
 

探索从野生水果到栽培水果的轨迹对于全面理解水果新陈代谢和人类选择对番茄果实正面和负面品质性状的影响是必不可少的。本研究借助多组学技术,通过野生番茄基因组区域的渗入,研究了基因表达、代谢产物和病原体敏感性的变异对栽培物种遗传背景的影响。
 

首先,在成熟的番茄果实中发现了GAME31和GAME5可作为SGA途径的核心酶,通过这些中间体和酶活性,即作为绿色番茄果实中存在的基本抗营养和防御生物碱α-番茄碱,在果实成熟期间被转化为七叶皂苷和番茄红素。这种化学转变是非常重要的,以减少α-西红柿的苦涩味以及抵消对防御性水果代谢物的暂时需求。此外,分析了促进健康的类黄酮在水果皮肤组织中积累有关的基因座和基因。观察到的基因表达和代谢变化(例如防御代谢产物的积累)也影响了复杂的表型,例如病原体抗性。
 

同时,作者还提供了番茄果实最常见的真菌病原菌之一灰霉病菌(Botrytis Cinerea)获得的抗性的分子数据,并鉴定了与提高番茄灰霉病菌抗性相关的代谢物和基因。本文探讨了3′,5′-葡糖基根皮素(3′,5′-di-C-glucosylphloretin)和泛酸在果实抗灰霉病中的作用,研究者认为泛酸对灰霉病菌生长的直接影响表明泛酸本身是一种保护性代谢物。灰霉病抗性也与病原体反应相关转录物的协同变化有关。另外,所选候选物(即ACD2、ACO5和4CL-Like)的功能特性揭示了它们在果实抗灰霉病中的作用。
 

研究结论
 

本研究利用秘鲁野生番茄品种(LA0716或PI246502)和现代栽培品种番茄M82构建了番茄的作图群体。通过对580个系的转录组和代谢组分析,结合病原体敏感性分析,确定了与数百个转录本和代谢产物水平相关的基因组位点。另外,本文鉴定了茄碱途径的组成部分,以及参与病原体防御的基因和代谢物,并将真菌抗性与果实成熟调控网络的变化联系起来。该研究结果为理解番茄果实成熟过程中的代谢和病原菌抗性提供了一个框架,并为研究关键果实品质性状提供了依据。
 

小鹿推荐
 

本研究通过非靶向代谢组学RNA测序相结合,以及整合QTL作图群体解析并勾勒出番茄果实成熟过程中次生代谢物和病原菌抗性的遗传调控网络。这项研究推测出的基因型-表型关联将对目前的分子育种做出重大贡献,有助于对抗风味和抗病性等关键水果质量性状的丢失。
 

鹿明生物

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参考文献:

1.Zhu, G. et al. Rewiring of the fruit metabolome in tomato breeding. Cell 172, 249–261.e12 (2018).

2.Soyk, S. et al. Bypassing negative epistasis on yield in tomato imposed by a domestication gene. Cell 169, 1142–1155.e12 (2017).

3.Alseekh, S. et al. Canalization of tomato fruit metabolism. Plant Cell 29, 2753–2765 (2017).

4.Cárdenas, P. D. et al. Pathways to defense metabolites and evading fruit bitterness in genus Solanum evolved through 2-oxoglutarate-dependent dioxygenases. Nat. Commun. 10, 5169 (2019).

5.Itkin, M. et al. GLYCOALKALOID METABOLISM1 is required for steroidal alkaloid glycosylation and prevention of phytotoxicity in tomato. Plant Cell 23, 4507–4525 (2011).


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文章来源于鹿明生物

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