组学干货

标志物筛选、药效评价保姆级代谢组学组学研究实验思路!

编者按

 

本期是小鹿话代谢系列第五期~~在前2期,小鹿分享了代谢组学在医学领域的实验设计思路之机制研究,详情请访问鹿明WX公众号:一看到导师就害怕?你也有“导师恐惧症”吗?看完秒懂,代谢组学医药领域机制研究实验设计方案怎么做?
 

因此本篇小鹿依然针对代谢组学在医药领域的应用和实验设计方案在标志物筛选药效评价方面的重点运用。利用实际案例与研究结果相结合,让我们来看看代谢组学在医药领域的研究应用怎么做才能发高分文章

标志物筛选
 

代谢处于生命活动的最下游,上游信号的变化很容易通过级联放大效应在代谢表型中体现,从这个角度来讲,代谢作为标志物天生具有灵敏度高的优势。但是,代谢物跟基因和蛋白相比,其特异性较差(包括种属之间、器官之间、甚至疾病之间),再加上代谢物的定量分析比基因和蛋白要复杂不少,因此,迄今临床上使用的诊断标志物大都是蛋白类的。随着质谱技术的不断迭代,现代分析分离技术的不断发展,代谢物定性定量的准确性和高通量分析能力得到了极大提升,未来筛选代谢诊断标志物应用于临床还是大有可为的。
 

以临床样本为基础
 

基本信息

案例来源:《Journal of Hepatology》 2020, IF=20.58 (López-Vicario et al. Journal of Hepatology,2020; S0168-8278(20)30208-7.)

doi: 10.1016/j.jhep.2020.03.046

原文链接:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32294533/

研究目的:研究多不饱和脂肪酸的代谢物与代偿性肝硬化及急性肝衰竭之间的关系

样本来源:

18个健康对照+127个急性失代偿性肝硬化(AD)+119个急性肝衰竭(ACLF)

研究手段:定量分析三个群体血清中100多个多不饱和脂肪酸代谢物的含量,并与病情的 恶化程度进行关联分析,找出病情指示性标志物 。

主要技术:氧化脂质的靶向定量检测(LC-MS/MS)
 

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实验设计和关键结论展示

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图 | 实验设计和分析流程
 

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结论1:总多不饱和脂肪酸(LA, AA, EPA, DHA)在急性失代偿性肝硬化(AD)和急性肝衰竭(ACLF)都呈现下降的趋势,但游离的AA 在AD 和ACLF中是上升的,此外AA/EPA 在AD 和ACLF中都是上升的,AA的代谢产物主要是促炎症因子,EPA的代谢产物主要是抗炎症因子,AA/EPA是体内系统性炎症的指标,该比值升高表示AD和ACLF的炎症负荷增加。
 

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结论2:白三烯E4(LTE4)可以用来区分病情的严重程度,其含量在健康组、AD、ACLF 1期,2期,3期中层逐渐上升趋势。
 

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结论3:LXA5 和EKODE 与肝衰和血衰相关,而PGF2α 则与心衰相关。升高的EKODE和LTE4 和下降的LXA5 与患者的28天生存期显著相关。
 

小鹿点评
 

这篇论文的设计思路并不复杂,利用三个群体(HC, AD, ACLF)及后续跟踪样本的氧化脂质的绝对定量数据,结合临床资料,分析各氧化脂质与病情发展的关系,找到指示性标志物。但从实验样本来看,并不算多(共计200多个样本+一百多个跟踪样本),使用的检测技术也并不复杂,但是最终能在肝病领域最的期刊上发表,个人认为主要得益于两方面:1、样本很珍贵(极性肝衰竭群体),且做了一次跟踪检测,病理资料也非常详细;2、分析和讨论做的非常深入,数据的挖掘做到了最大化。
 

小鹿物语
 

临床样本的的数量和质量(样本稀缺性、病理资料(包括跟踪和回访)的完整度)是发医学期刊的关键因素之一。因此在搜集临床样本的过程中需要注意几点

(1)多中心合作,既能快速增加样本的例数,缩短样本的准备时间,又能增加队列样本的遗传和环境因素多样性,使得最终的结果具有普适性;

(2)样本的收集需要多备份分装保存,避免检测样本的反复冻融,尤其是像氧化脂质这类的代谢物,非常容易降解,冻融一次几乎要降解1/4,因此分开低温保存非常关键,此外这类脂质分子很容易被氧化,从这个角度来说,其实这类氧化脂质小分子并不特别适合做标志物;

(3)病理资料尽量周全,这样后续才能做各种跟临床指标相关的数据分析,使得数据挖掘更加深入。
 

以实验动物为基础
 

基本信息

案例来源:《Analyst》 2020, IF=4.0 (Jia et al. Analyst,2020; 145(10): 3575-3591.)

doi: 10.1039/d0an00385a

原文链接:

https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/32329491/

研究目的:建立104种功能性脂质的高通量定量分析方法,并用于大鼠性急肝损伤标志物的筛选和脂代谢研究

样本来源:大鼠急性肝损伤模型

研究手段:LC-MS/MS技术精准靶向104种功能性脂质,并结合关键代谢酶的免疫组化分析急性肝损伤鼠模型的脂代谢特征和相关机制

使用技术:104种功能性脂质(含氧化脂质、磷脂和胆固醇代谢)的靶向定量检测(LC-MS/MS)
 

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实验设计和关键结论展示
 

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图 | 实验设计和分析流程
 

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结论1:通过前处理和色谱质谱方法的优化,建立了104种功能脂质的高通量分析方法,其中氧化胆固醇和低丰度磷脂在正离子模式下检测,高峰度的磷脂,溶血磷脂、胆汁酸和类二十烷酸在负离子模式下检测。

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结论2:7α-hydroxycholesterol 和7β-hydroxycholesterol在CCl4诱导的肝损伤组血清种含量显著下降,ROC分析时灵敏度和特异性都能达到100%,可以作为肝损伤的潜在血清标志物。

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图 | 诱导的肝损伤的脂代谢机制图


小鹿点评
 

这篇论文是一个功能性脂质靶向高通量检测的方法学开发,然后加了一个动物模型的应用,这个功能性脂质靶向高通量检测涵盖了氧化脂质的代谢通路、胆汁酸通路、氧化胆固醇代谢通路、磷脂代谢通路的重要活性脂质,对于很多疾病的诊断标志物筛选和脂代谢机制的研究是有帮助的。
 

小鹿物语
 

新的方法学的开发+简单的应用也是发文章的常用手段,这样类型的文章要求方法具有一定的创新性,比如(代谢物的高通量检测、修饰蛋白的富集和检测、外泌体的富集、循环肿瘤细胞的检测等等) ,然后再加上一些简单的应用就能发表一篇论文,如果后面能衔接临床大样本的分析检测和分子机制的验证分析,发表论文的层次就会比较高了。
 

药效评价
 

中药由于其多成分多靶点的特性,常常导致其活性成分不清、药理机制不明,对于其药效的评价也仅限于表观数据的观察(如肿瘤大小、体重、常规生化指标),缺乏深层次的指标验证其疗效,利用代谢物组学技术结合时间轨迹分析,可以完整观察到,动物模型从健康到疾病组的代谢谱变化轨迹,同时,药物干预后,如果效果理想,又能看到疾病组的代谢轨迹逐渐向健康组代靠近的过程,可以客观评价药物的有效性,其次,也能在一定程度上展示中药对疾病模型异常代谢通路的纠正作用。
 

中药提取物的药效评价
 

基础信息

案例来源:《Metabolomics》 2015, IF=3.66 (peng et al. Metabolomics, 2015; 11, 636–656. )

doi: 10.1007/s11306-014-0725-z

原文链接:

https://link.springer.com/article/10.1007/s11306-014-0725-z

研究目的:研究木香提取物对裸鼠乳腺癌的药效和药理机制

样本来源:小鼠乳腺癌模型

研究手段:利用代谢组学技术研究小鼠模型和中药干预后的代谢轨迹,评价木香中药提取物的药效

主要技术:GC-MS和LC-MS非靶向代谢组学技术
 

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实验设计和关键结论展示
 

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图 | 实验设计和分析流程
 

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结论1:图1A显示,阳性对照紫杉醇组(PTX)抑制肿瘤效果最佳,木香提取物的活性成分(Cos+Dehy)联合用药组和木香挥发油组(VOSL)抑制乳腺癌生长效果其次,但是PTX组裸鼠体重用药后急剧下降,而VOSL组裸鼠体重保持的很好,荷瘤裸鼠的活力也非常好。
 

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结论2:药物干预组(Cos-Dehy)组和VOSL组裸鼠的代谢轨迹与阴性对照组(NT)相比,明显更接近健康组(HC)的代谢谱,说明(Cos+Dehy)是VOSL中的主要抗乳腺癌活性成分。
 

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结论3:(Cos-Dehy)和VOSL 对裸鼠乳腺癌模型失调的代谢通路均有回调的作用,但是VOSL的干预效果更佳。
 

小鹿点评
 

这篇论文使用中药分段的提取物结合动物模型和代谢组学技术去研究中药的活性成分,并进行药效评价和初步机制的探索,对于多成分多靶点的中药研究具有一定参考价值。
 

小鹿物语
 

中药的单方或复方化学成分非常复杂,这将会导致其活性成分不清楚,药理机制不清楚,质控和现代工业化生产困难,因此很难被现代的医药体系(尤其是西方国家)所接受。中药现代化,就是要尽量保持中药“多成分、多靶点、系统治疗”特点的同时,朝着活性成分清楚、药理机制明确、质量可控的方向努力。活性成分确定是中药现代化至关重要的一环,中药的活性成分往往是多组分作用于多靶点,最终产生协同的药理作用。
 

代谢组处于生命活动的最下游,中药多成分干预机体后的协同药理效应会在代谢谱上得以体现,从这个角度来讲,代谢轨迹分析挺适合中药的药效评价和作用机制(代谢层面的)研究。此外,在用动物模型进行代谢组的研究过程中需要注意,鼠龄对于代谢谱的影响极大,因此需要注意对照组和实验组使用相同周龄的老鼠。
 

鹿明生物
 

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上海鹿明生物科技有限公司,一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀,公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、精准靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台,并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。


END

文章来源于鹿明生物

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