组学干货

Science:16S+代谢组学如何进行识别辐射幸存者的辐射防护机制研究

前言

 

2020年10月Science期刊发表的题为 “Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites”的研究成果,通过16S rRNA基因测序代谢组学研究方法,探究了肠道菌群与放疗辐射的相关性,发现了具有防护作用的特征微生物菌群和代谢物,首次探究肠道菌群对放疗辐射的保护机制,为其临床研究提供了理论依据和基础。
 

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中文标题:多组学分析可识别辐射幸存者的辐射防护微生物和代谢物

英文标题:Multi-omics analyses of radiation survivors identify radioprotective microbes and metabolites

研究对象:粪便样本

发表期刊:SCIENCE

影响因子:44.372

发表时间:2020.10.30

运用生物技术:16S rRNA基因测序、靶向代谢组学+非靶代谢组学
 

研究背景
 

大剂量电离辐射的毒性会诱发急性辐射综合症,进一步表现为造血、胃肠道和脑血管综合症。肠道是辐射的主要目标,也是肠道菌群的生长场所。尽管少量描述性研究已显示肠道菌群与辐射引起的损害之间存在潜在相关性,但其基础仍然不清楚。
 

作者发现一种C57BL/6J小鼠在高剂量的全身辐射中能存活下来,它们与不能在辐射中幸存的小鼠具有相同的遗传背景,因此促使研究方向转向寻找与放射防护有关的微生物群差异。为了更好地了解肠道微生物组与辐射诱发的损伤之间的相互作用,作者进行了微生物群过继转移实验以及单关联研究,以研究肠道辐射模型中肠道细菌群落和特定细菌菌株的功能,并通过代谢组学技术发现了在放射防护中起重要作用代谢物。
 

实验思路
 

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研究方法
 

1.实验对象

6-8周野生型C57BL / 6J小鼠(雄性和雌性)全身经过8.0至9.2 Gy的辐射(未经受辐射小鼠作为对照组)。经过辐射30天后未表现出损伤或伤害的小鼠被认为是精英幸存者。辐射后第290天,收集粪便样本进行微生物组分析。


2.防辐射效果验证试验

(1)脏笼共享实验

将六至八周大的SPF C57BL / 6J小鼠关在对照组和精英幸存者生活过的带有粪便的脏笼子中,持续8周每周将小鼠转移到新的脏笼中,最后一天这些小鼠接受高剂量的全身辐射,辐射前收集粪便DNA用于微生物组分析。

(2)粪菌移植(FMT)实验

GF或SPF C57BL / 6J小鼠每周两次服用对照组和精英幸存组的粪便,持续4周(GF受体)或8周(SPF受体),最后一次FMT后接受高剂量辐射,辐射前收集粪便DNA用于微生物组分析。

(3)服用益生菌实验

SPF C57BL / 6J小鼠先接受抗生素治疗(20 mg链霉素/小鼠)一天后,每周两次给小鼠喂食Lachnospiraceae(毛螺菌科)菌株,持续8周。最后一次给药后,接受者接受高剂量的全身辐射治疗。

(4)短链脂肪酸(SCFA)和色氨酸治疗实验


3、辐射临床效果评价实验

(1)组织病理学实验:脾脏,股骨,小肠和结肠;

(2)肿瘤接种和放射治疗;

(3)粘蛋白的免疫标记以及测量粘液层和隐窝长度;

(4)肠通透性检测,骨髓干细胞内ROS水平检测;

(5)分离骨髓干细胞、肠上皮细胞和肠上皮内淋巴细胞;

(6)免疫印迹分析:骨髓干细胞,肠上皮细胞,肠上皮内淋巴细胞或脾脏组织;

(7)流式细胞仪分析;
 

4、组学实验

(1)16S rRNA基因测序;

(2)代谢组学实验: 短链脂肪酸靶向定量检测LC-MS非靶向代谢组学


5、其他临床数据
21名白血病患者接受放疗前的粪便;

研究结果
 

1、精英幸存者存在独特的微生物
 

经过高剂量辐射(9.2 Gy)后,有5至15%的SPF C57BL / 6小鼠(被称为“精英幸存者”)可以长期存活(600天以上)(图1A)。为了确定肠道微生物群是否对精英幸存者具有特异性,作者在辐射后第290天对粪便微生物进行了高通量16S rRNA基因测序分析,分析结果显示,精英幸存者与对照组相比具有独特的微生物群落(图1B)。可通过UniFrac差异距离分析(图1C)进一步量化数据,并得到微生物分类单位的热图(图1D)。从这些结果可推测:特定肠道菌群可以防止辐射损伤。
 

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图1 | 与对照组相比,“精英幸存者”有独特的肠道菌群


2、微生物群介导的放射防护
 

(1)脏笼实验证实精英幸存者的微生物群可促使宿主抵抗高剂量辐射

在精英幸存者(ES-Recip)脏笼中饲养的小鼠(接受者)有近75%能在高辐射下存活,而在对照组(Ctrl-Recip)脏笼中饲养的小鼠只有20%存活(图2B)。ES-Recip(图2C)小鼠的临床评分显著较低。组织学研究结果表明,与Ctrl-Recip小鼠相比,ES-Recip骨髓标本基质损伤减少、胱天蛋白酶3标记的造血细胞死亡减少以及Ki67染色增强。ES-Recip小鼠的脾脏结构接近正常,白色牙髓富含淋巴细胞的卵泡,红色牙髓表现出髓外造血。相反观察到Ctrl-Recip脾脏明显萎缩和淋巴细胞减少。在来自ES-Recip小鼠的脾脏中也观察到裂解的半胱天冬酶3染色和免疫印迹的减少以及Ki67染色增加。这些结果表明,精英幸存者的微生物群可通过促进造血细胞增殖和减少细胞死亡来介导宿主抵抗高剂量辐射。
 

16S rRNA基因测序分析结果显示,与Ctrl-Recip小鼠相比,ES-Recip小鼠的微生物组组成有所不同(图2,D和E)。即与对照组相比,Erysipelotrichales菌丰度显著下降,同时精英幸存者中拟杆菌和梭状芽胞杆菌的丰度增加。接受者的微生物组组成与其各自供体的相似,表明脏笼共享策略可以有效地将肠道菌群从提供者交换到接受者(图2D)。
 

(2)粪便微生物群移植(FMT)实验证实微生物与辐射防护的关系

FMT实验发现,精英幸存者使GF和SPF小鼠的存活率提高,与对照小鼠相比,临床得分降低(图2,I和J)。使用线性判别分析(LDA)直接比较GF ES-Recip和Ctrl-Recip小鼠的粪便微生物丰度,ES-Recip小鼠中八种分类单元增加,而五种分类单元减少(图2M)。火山图显示, Lachnospiraceae(毛螺菌科)是ES-Recip小鼠中最丰富的微生物(图2N)。
 

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图2 | 来自精英幸存者的肠道菌群可以保护GF和SPF小鼠免受辐射诱发的死亡
 

(3)辐射防护微生物群与人类相关性研究

使用16S rRNA基因测序鉴定21位白血病患者肠道微生物组成,分析了所有患者的链霉菌和肠球菌的丰度(图3,A和B)。腹泻持续时间较短(<10天)的患者与腹泻持续时间较长(> 10天)的患者相比,鞭毛藻科和肠球菌的丰度明显更高,乳杆菌科也有增加的趋势,在患者中,Lachnospiraceae(毛螺菌科)丰度与胃肠道不良反应的发生之间存在统计学的显著负相关(图3B)。
 

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图3 | 无论是患者还是小鼠肠道菌群与辐射防护显著相关
 

3. 小鼠微生物群的放疗后选择
 

与人类不同,实验所用小鼠应具有相似的基础微生物组组成。为了解精英幸存者携带放射防护菌群的原因,作者调查了在辐射前后是否选择了一个独特的微生物菌群在精英幸存者中占主导地位(图3C)。对57只SPF C57BL / 6小鼠进行了高剂量的全身辐射(8.2 Gy),并在放射治疗前(第1天)和第2、7、21和30天收集粪便样本进行16S rRNA基因测序,存活超过30天的小鼠被认为是精英幸存者。辐射前(第1天)精英幸存者和非幸存者之间的微生物组成没有差异。但辐射后第7天,精英幸存者有一个与辐射后死亡小鼠不同的微生物群落(图3E)。与辐射致死的小鼠相比,具有Lachnospiraceae(毛螺菌科)和Enterococcaceae(肠球菌科)的小鼠在放疗后的第7天显示出更高的存活率(图3F)。这些数据表明,放射治疗对精英幸存者的两种菌群具有选择性。
 

作者对Lachnospiraceae(毛螺菌科)和Enterococcaceae(肠球菌科)介导的放射防护进行深入研究。向SPF C57BL / 6小鼠接种4种微生物(图4A),前两种为Lachnospiraceae(毛螺菌科)和Enterococcaceae(肠球菌科),后两种为对照菌群,通过FMT实验发现前两种菌群能减轻放射的副作用,在放疗条件下具有放射防护作用。
 

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图4 | 毛螺菌改善了辐射诱发的综合征


4. 防护辐射的代谢介质
 

Lachnospiraceae(毛螺菌科)可产生短链脂肪酸(SFAC,维持肠道上皮以及调节免疫系统和炎症反应的重要底物)。实验发现精英幸存者或ES-Recip小鼠的粪便样品中三种SCFA的浓度均高于对照。酯也显示出明显的上升趋势,并且ES-Recip小鼠中的酯和总SCFA含量显著升高。为了确认SCFA在微生物群介导的放射防护中的作用,作者测量了高产或低产Lachnospiraceae(毛螺菌科)产生的SCFA数量,并且确认三种高产菌株进行的处理组可保护100%的小鼠免于辐射,而这三种低产菌株仅提供50%的保护。
 

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图5 | 商业相关的SCFA抑制辐射引起的死亡和伤害
 

组织学分析表明,酯处理导致骨髓细胞增多,脾脏白、红髓恢复(图5D)。此外减弱了辐射诱导的粒细胞-巨噬细胞祖细胞(GMP),普通髓样祖细胞(CMP)和巨核红细胞祖细胞(MEP)的减少。通过Western blot检测与DNA损伤相关的蛋白质的水平,包括gH2AX(图5G)、p53和53BP1。与未接受辐射的小鼠或酯相比,ROS水平降低了50%至60%。最终作者认为Lachnospiraceae(毛螺菌科)可提供长期保护,其中保护作用长达 400天以上(图5I)。
 

为了确定其他代谢物是否具有放射防护作用,对自精英幸存者和对照组的粪便样本进行了非靶标代谢组学测定。精英幸存者和对照之间的代谢产物差异很大(图6A和B),共找到141个差异代谢物。精英幸存者粪便中代谢最丰富的代谢产物聚集在色氨酸代谢途径中,其中吲哚3-甲醛(I3A)含量变化了5倍,而犬尿酸(KYNA)变化了8倍(图6C和D)。对这些色氨酸代谢产物进行了体内放射线抑制测试,发现这两种代谢物均能显著提高放射处理的SPF小鼠的存活率并降低其临床评分(图6E至G)。I3A和KYNA治疗组均显示约75%的存活率,且放射后的保护持续时间超过200天(图6H)。
 

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图6 | 非靶向代谢组学显示色氨酸代谢物是有效的辐射防护物


相关讨论
 

肠道微生物及其代谢组可对辐射诱发的小鼠损伤提供实质性的保护:
 

研究表明Lachnospiraceae和Enterococcaceae的存在与恢复造血功能和修复胃肠道有关。在接受放射治疗的白血病患者中,这两种微生物分类更为丰富,且表现出轻度的胃肠道功能障碍。以及两个色氨酸途径代谢产物(I3A和KYNA)在精英幸存者中升高,并提供了长期防辐射保护。表明肠道微生物群及其代谢产物可延迟放射损伤并延长生命。

短链脂肪酸可以在放射后直接促进造血作用和肠道修复,通过降低促炎细胞因子水平或诱导抗炎细胞因子白细胞介素-10,广泛抑制全身性炎症。此外本研究表明色氨酸代谢产物I3A和KYNA可以抵抗ARS。色氨酸代谢物也能减弱促炎细胞因子的反应,非靶向代谢组学方法显示色氨酸代谢物在放射幸存者中升高。色氨酸代谢物可以直接减少辐射引起的损害,是候选的辐射防护剂。除色氨酸代谢物外,精英幸存小鼠中其他代谢物也升高。需要进一步的研究确认它们是否也具有辐射防护。
 

研究结果
 

过量辐射会导致急性辐射综合症,从而导致造血,胃肠道和脑血管损伤。作者调查了从高剂量辐射中仍有正常寿命的小鼠种群,这些“精英幸存者”拥有独特的肠道菌群,这些菌群在无菌和常规饲养的接受者中保护它们免受辐射引起的伤害和死亡。
 

Lachnospiraceae和Enterococcaceae菌群家族的丰度升高与放射后造血功能的恢复和胃肠道修复有关。这些菌群含量更高的白血病患者接在接受放射治疗后表现出较轻的胃肠道功能障碍。对小鼠的代谢组学研究揭示了精英幸存者粪便中微生物产生的酸和色氨酸代谢物浓度增加,这些代谢物引起长期放射防护,减轻了造血和胃肠综合征,并降低了促炎反应。
 

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本研究首次揭示了肠道菌群和放疗辐射之间潜在的相关性,并找到了一些关键代谢产物。文章通过微生物16S rRNA基因测序分析,找到通过精英幸存者小鼠特有肠道菌群,使用特有的“脏笼实验”,并结合临床病例,揭示了不同菌群和短链脂肪酸代谢相关的保护机制,并使用非靶向代谢组学手段找到了具有放射防护功能的色氨酸代谢物。实验设计详实、逻辑性强、数据充分,实验结果具有较大的临床转化意义。是一篇基础研究和临床研究结合的典范。

16S+代谢组学 /鹿明生物/
 

本文运用肠道菌群16S rRNA基因测序+代谢组学研究首次揭示了藏到菌群和放疗辐射之间潜在的相关性,并找到了一些关键代谢产物。鹿明生物针对16S+代谢组学特推出了多组学研究活动,助力各位老师的组学研究~
 

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参考文献:
 

1. M. Hauer-Jensen, J. W. Denham, H. J. Andreyev, Radiation enteropathy: Pathogenesis, treatment and prevention.Nat. Rev. Gastroenterol. Hepatol. 11, 470–479 (2014).

2. A. K. Shadad, F. J. Sullivan, J. D. Martin, L. J. Egan, Gastrointestinal radiation injury: Prevention and treatment. World J. Gastroenterol. 19,199–208 (2013).

3. A. L. Kau, P. P. Ahern, N. W. Griffin, A. L. Goodman, J. I. Gordon, Human nutrition, the gut microbiome and the immune system. Nature 474, 327–336 (2011).

4. P. A. Crawford, J. I. Gordon, Microbial regulation of intestinal radiosensitivity. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 102, 13254–13259 (2005).

5. M. A. Ciorba et al., Lactobacillus probiotic protects intestinal epithelium from radiation injury in a TLR-2/cyclo-oxygenase-2-dependent manner. Gut 61, 829–838 (2012).


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文章来源于鹿明生物

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