组学干货

Get农学领域——标志物筛选、机理研究的代谢组学实验设计方案!

随着代谢组学的发展与应用,其相关技术和理论已被用于多个领域。尤其是农业领域,已经形成了一套完整的研究思路与体系。

小鹿这次来向大家介绍代谢组学在农业方向的应用及相关实验设计。代谢组在农业领域的主要应用可简要概括为三大类。(见下图)

第一类为生物标志物筛选:以动植物细胞组织为样本,比对农业生产中动植物重要差异性状代谢表征,找出潜在的生物标志物,用于农产品真假鉴定、风味或安全性检测及动植物疾病诊断等领域;

第二类为代谢机理研究:一般与其他组学包括基因组、转录组、蛋白组,表观组在内进行联合性分析,多用以探究样本代谢组变化的分子机制和遗传基础,为农业动植物的遗传育种提供借鉴;

第三大类为代谢流研究:结合数学建模手段对生物代谢网络进行挖掘分析,展现生物代谢的动态变化,用以定向改良提高作物生产力。具体案例如下。
 

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一、生物标志物筛选
 

从生命中心法则来看,代谢位于生命活动调控的终端,是最接近表型的组学,更能直观反映机体被外界刺激或基因修饰后产生的响应变化。因此,将代谢物本身作为标志物,往往可以更直观地体现样本间差异。目前,利用代谢组检测生物标志物,已广泛用于农产品质检、病理分析及成分分析领域。
 

示例1

案例来源:《Food Chemistry》

原文链接:

http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0308814620309390

研究目的:利用代谢组分析不同饲料类型和煮熟对蛋黄及蛋清的影响

样本来源:源自玉米或大米饲喂的鸡生产的生鸡蛋和煮鸡蛋

研究手段:定量分析两种饲喂方式产生的生鸡蛋和煮熟后鸡蛋中,水溶性代谢物的含量差异,发现造成口感差异的标志性代谢物。

使用技术:水溶性代谢物的靶向代谢组学检测,其中使用了LC-MS/MS技术定量游离的糖类化合物,CE-MS技术定量游离的氨基酸、有机酸和生物碱等化合物。
 

实验设计和关键结论展示:
 

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图1 | 实验流程
 

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结论1:

通过对不同类型样本的代谢组数据进行主成分分析
 

发现鸡蛋中水溶性代谢物的含量变化,按高到低取决于下列因素:蛋黄与蛋清的差异(PC1:70.3%),煮熟对鸡蛋的影响(PC2:7.86%,PC3:3.22%),饲料类型对蛋黄的影响(PC4:2.55%);而仅针对蛋黄样本进行PCA分析时,可以发现饲料类型对蛋黄的影响更大(PC3:11.6%);仅针对蛋清样本进行PCA分析,同样可以发现饲料类型对蛋清的影响更大(PC2:10.5%)。

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结论2:

评估生鸡蛋和煮熟后鸡蛋中各种水溶性代谢物浓度之间的相关性,发现相对于蛋黄,煮熟对蛋清中的代谢物含量影响更大,而受影响的代谢物会随饲料类型而异。

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结论3:

评估玉米和大米饲喂得到的鸡蛋中代谢物浓度之间的相关性,发现在饲喂大米得到的熟蛋清中赖氨酸、谷氨酸,天冬氨酸含量比饲喂玉米的要低,因此,不同饲喂方式得到的鸡蛋中的代谢物含量也会被鸡蛋的生熟显著影响。


小鹿简评
 

本文的研究过程和使用技术并不复杂,但切入点比较新颖,前人研究发现味道的来源多为水溶性物质,文章从靶向检测这些水溶性代谢物入手,展示了在不水解的条件下,用代谢组评估不同饲料类型和加热条件下的鸡蛋不同部位成分差异的可行性。并发现了煮熟过程会影响鸡蛋白中水溶性代谢物的浓度,但对蛋黄影响小。相比于玉米饲喂鸡,水稻饲喂会使鸡蛋中甜菜碱和尿苷酸含量增加。


小鹿物语
 

这篇文章做的东西并不复杂,但却可以发表在一区的Food Chemistry上,关键在于其构思精巧、解释合理,分析精细,借助靶向代谢组学检测手段,找出差异代谢物,成功用代谢组手段揭示了,不同饲喂方式产生的鸡蛋,在生或熟时蛋清和蛋黄的口感差异可能来源于哪些代谢物的变异。
 

二、代谢机理研究
 

单一的代谢组学分析只能揭示机体代谢的动态变化。定性定量代谢物,并不能说明代谢变化的分子与遗传基础。多组学联合分析的手段,则可以帮助研究人员更好地挖掘表型变化背后的形成机制。目前,代谢组联合其他组学,如“代谢组”+“转录组”等联合分析已广泛用于分子机制研究中。
 

示例2

案例来源:《The Plant Journal》

原文链接:

https://onlinelibrary.wiley.com/doi/pdf/10.1111/tpj.14899

研究目的:探究常绿植物耐寒性的分子机制

样本来源:常绿杜鹃花“Elsie Lee”的叶片

研究手段:通过靶向代谢组学转录组学技术对比常绿杜鹃花在自然冷驯化和人工冷驯化处理的植物代谢和转录水平的差异,寻找与植物冷驯化机制相关的代谢途径与基因,尝试揭示常绿植物冷驯化的遗传基础。

使用技术:生理生化实验、转录组分析、靶向代谢组分析(由鹿明生物提供技术支持)。
 

实验设计和关键结论展示

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图2 | 实验设计
 

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结论1:

通过转录组学分析发现,实验I,II和III分别富集到23、26和31条KEGG通路。实验I特有的8条途径涉及光合作用或保护作用,以及脂肪酸代谢途径。在三个实验共有的11条通路,包括涉及碳水化合物代谢的5条途径、次级代谢的3条途径、氨基酸代谢1条途径,脂质代谢和昼夜节律相关途径各1条,上述富集到的通路为探索完整冷驯化机制提供了充足的组学信息。
 

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结论2:

在实验I,II和III中,有5条碳水化合物代谢途径富集了大量差异基因,分别是抗坏血酸和糖代谢、碳代谢和二羧酸代谢途径。途径中大多数差异基因在实验I中上调,而在实验II和III中下调。在实验I中,叶片葡萄糖和果糖浓度增加程度远高于实验II和III,而蔗糖在实验I、II和III增加的程度接近,表明对于冷驯化而言葡萄糖和果糖比蔗糖更重要。
 

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结论3:

常绿植物“Elsie Lee”,在初秋可能因为对光信号的响应而积累脱落酸(ABA)和茉莉酸(JA)从而导致植物在冬季到来后完成冷驯化。冬季到来后,ABA和JA含量下降,这可能与多不饱和脂肪酸的积累和玉米黄质被用于光保护作用有关。相比于人工冷驯化,自然冷驯化叶片中会积累更多的花青素,葡萄糖和果糖,从而表现出更强的耐寒性。
 

小鹿点评

耐寒性一直是植物抗胁迫(逆)研究的关注热点之一,作者使用常绿植物“Elsie Lee”比较田间和人工冷驯化的转录组学代谢组学差异,结合植株冷驯化过程中的生理生化数据,揭示了利用人工驯化机制理解自然冷驯化机制存在着局限性,秋季低温前的光信号是植物自然冷驯化所必需的。
 

小鹿物语
 

对于探究复杂的生理表型的遗传机制,单一的代谢组分析并不能详细解释其生物学原理,多组学联合的手段往往更为有效。
 

三、代谢流分析

随着代谢组研究的不断深入,单一时间点的代谢物检测,并不能直接向我们展示样本在外界刺激或者基因修饰下的动态响应变化过程。结合数学建模与代谢组实验的代谢通量(流)分析,利用同位素标记前体物质培养植物,通过连续取样检测的方式,使得动态监测代谢变化成功实现。目前,代谢流分析已广泛用于作物光合研究中。
 

实例三

案例来源:《PNAS》

原文链接:

https://www.pnas.org/content/111/47/16967

研究目的:基于13C标记的代谢流分析高光适应对拟南芥叶片的代谢影响

样本来源:温室中生长的拟南芥叶片

研究手段:选取13CO2标记的不同光强下处理后的28天拟南芥叶片,用LC-MS/MS和GC-MS靶向代谢组等技术,来检测叶片中光合作用终产物和中间产物的动态代谢变化。

使用技术:LC-MS/MS靶向代谢组,GC-MS靶向代谢组,Enzymatic assay,Western blot,GC-FID技术
 

实验设计和关键结论展示:

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图3 | 实验设计

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结论:
 

本文成功构建了一套综合的代谢流分析模型,包括卡尔文循环、光呼吸、分叉三羧酸循环途径和淀粉、蔗糖和氨基酸等生物合成途径。研究结果全面地描述了叶片适应强光后,发育过程中碳分配和总光合量的变化。尽管羧化速率增加了一倍,但在高光适应后,叶片的光呼吸通量从净二氧化碳吸收量的17%增加到了28%,说明光合碳通量会适应强光而发生改变。


小鹿推荐
 

作为第一篇将13C同位素标记的代谢流分析成功应用于描述陆生植物系统光合通量动态变化的文章,成功定量描述了植物叶片在适应强光后的代谢动态变化,并详细说明了一种描绘植物中碳代谢网络动态变化的方法,为后续提高植物生产率提供了新的思路与见解。
 

小鹿推荐
 

文章研究方法新颖,成功将数学建模与代谢组检测相结合,结合了不同学科手段,展现了代谢组广阔的应用领域。
 

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文章来源于鹿明生物

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