组学干货

代谢组学样本收集知多少~超全攻略让你轻松get!!!

千里之行,始于足下!样本的正确收集以及预处理是实验成功的重要起点,鹿明生物具有多年代谢组学分析经验,给您带来生物样本收集以及预处理经验的干货分享。

 

取样基本原则
 

1.代表性和一致性

实验组与对照组样本在取材部位、时间处理等方面尽可能保持一致,从而保证实验的可信度;

2.迅速性

操作过程迅速,最大限度缩短样本采集到实验的时间;

3.低温原则

所有样本离体后,分离步骤应在4℃或冰上进行,分离好的样本立即存于-80℃,以免样本产生进一步代谢活动;
 

血液样本收集指南


血清:

1)用促凝管(没有促凝管则用离心管)收集血液,将促凝管/离心管直立、静置于试管架上,避免振荡、摔落;

2)避免阳光直射,室温;

3)检查凝血完全后,2500 ~ 3000 rpm,4℃ 低速离心5 min,吸取200 µL上清液至1.5 mL离心管中,若上清液较多可每管200 µL、多管分装,于-80 ℃冻存待用;

4)严禁反复冻融,如发生溶血则该样本不合格、需重新准备样本。合格样本用干冰运输。
 

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血浆:

1)用抗凝管采血,采血后立刻轻柔上下颠倒8次,使抗凝剂与血液均匀混合(轻柔,以避免产生溶血);

2)2500 ~ 3000 rpm,4 ℃低速离心5 min,吸取200 µL上清液分装至1.5mL离心管中,-80 ℃冻存待用;

3)血液样本采集后应立即把血浆从全血中分离出来,最晚不迟于采血后1 h内分离出血浆。合格样本用干冰运输。


温馨提示:

(1)试管的使用

涉及到RNA等的多组学实验取样,请勿使用肝素钠抗凝管(对 RNA 相关实验有严重影响,抑制反转录酶活性而导致cDNA量不足);

核磁实验(NMR)请勿使用EDTA抗凝管(影响图谱采谱);

代谢实验取样不建议使用柠檬酸钠抗凝管(柠檬酸是TCA循环中的重要物质,使用柠檬酸钠抗凝剂会引入外源污染),请根据实验具体情况选用合适的抗凝管。

(2)影响因素

取血时如用酒精消毒,请擦干擦拭部位,待酒精完全挥发后再取样;

取血时如有使用麻醉剂,建议用异氟醚消毒,以避免在谱图中出现干扰峰。

(3)产率

血清参考产率:30% ~ 50%(例如:1 mL 全血大约能得 0.3 ~ 0.5 mL 血清)。

血浆参考产率:≈ 50 %(例如:1 mL全血大约能得 0.5 mL 血浆)。

采全血时如使用真空采血管,建议使用促凝管。

(4)冻存管的使用

强烈推荐收集尽量多的样本并分装冻存(同批次样本可以用于多项实验,且避免反复冻融而导致结果不理想),分装保存时推荐使用1.5 mL离心管,因为螺口冻存管帽内有一个密封用的橡胶垫圈,长期在-80 ℃/干冰等低温下,橡胶圈会变硬脆、易脱落,导致管口密封不严,样本渗露。
 

粪便样本收集指南


人粪便:

1)将粪便直接排泄到干净的容器中,尽量避免尿液、马桶壁等对粪便样本的污染,取同时间段样本或将所有样本混匀后再取样;

2)用无菌勺对粪便样本进行挖取,将适量粪便样本放入无菌保存管中,分装样本200 mg/管,迅速放入液氮中15min以上进行淬灭处理;

3)采集好的样本立刻放入-80 ℃保存待用。
 

小鼠/大鼠粪便:

1)将待取的小鼠/大鼠放进干净的铺有消毒滤纸的笼子里,排便后立即用无菌镊子转入冻存管;

2)小鼠粪便6-8粒,大鼠粪便2-3粒;

3)若样本需要重复检测,可用无菌棒混匀后多管分装,以避免反复冻融,样本采集后立刻放入-80℃保存待用。


温馨提示:

1.粪便样本尽量不要接触到尿液,避免多样本交叉污染,且尿液中含有大量尿素,干扰后续粪便样本检测。

2.粪便样本收集之后,建议先放入液氮中淬灭15 min后,再放入-80 ℃冻存。

3.建议统一粪便样本形态(如固态、液态(粪水)、冻干粪便等)

4.人粪便样本提供者在取样的近三个月内不可接受抗生素治疗。
 

尿液样本收集指南


尿液:

1)取空腹晨尿、中段尿(临床)或晨间1 h尿(动物)于50 mL离心管中;

2)4 ℃ 下10000 rpm离心10 min取上清,用1.5 mL离心管分装,保存于-80 ℃。

3)动物1 h尿量不够的情况下,可分多次收集尿液;如需收取24 h尿液,需要使用带低温装置的代谢笼收集,并且及时冻存样本。

4)收集完尿液样本后,建议使用液氮淬灭15 min后,再分装多管后于-80 ℃冻存。


组织样本收集指南
 

动物组织(包括脑、心、肝、脾、肺、肾、肌肉和皮肤等;软体动物如血吸虫):

1)取适量组织器官,用预冷的PBS缓冲液或生理盐水清洗干净;

2)迅速剥去非必需的脂肪和结缔组织,再用PBS缓冲液或生理盐水冲洗干净;

3)用干净的无尘吸水纸吸干水分,将组织分成50-100 mg / 管分装待用;

4)管子上做好标记后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min,-80 ℃冻存;干冰运输。

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植物组织:

叶片、茎、花:

1)取整片叶片/一段茎/一朵花,放入离心管或锡箔纸中并标记,迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

2)将装有样本的离心管迅速放入自封袋中(每组一袋),在自封袋中放入标签纸注明样本信息。

3)迅速放入-80 ℃冰箱冻存。足量干冰寄送。

注意:(1)采集叶片样本时,最好在中午光照好的时间收集。(2)采集样本时保持样本一致性,尤其是同一组样本(颜色、衰老程度、叶脉占比、光照、位置等)。


根:

1)取整株植物的根部,迅速用PBS缓冲液或者超纯水漂洗掉根上的泥土、培养基或营养液等;

2)吸水纸吸干水分后,分装为500 mg/管;

3)标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min,-80 ℃冻存,干冰寄送。
 

果实、种子:

1)对于含水量高、体积较大的果实(番茄、西瓜、苹果等)需要先将样品分成“均匀”的小块(≈ 200 mg/样本)分装至2 mL离心管中,标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

2)对于细小的颗粒种子(拟南芥种子、谷物种子等),可以先将同一组的植株种子混匀后再分装(≈ 200 mg/样本)至离心管中,标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15 min。

3)对于要求对整个果实进行提取的(整粒葡萄等),需要把果实装在50 mL离心管/自封袋中,标号后迅速放入液氮中冷冻处理至少15min,-80 ℃冻存,干冰寄送。


温馨提示:

1.对于动物组织样本无法满足50mg/样,如海马组织,大脑组织等,可考虑同组混样以达到50mg/样的要求。

2.对于含水量高的果实进行取样很难保持高度均一性(如番茄的果皮、果肉等),建议将整个果实进行液氮研磨后冻干混匀,对混匀后的粉末进行称重分装,冻存。

3.尽量不要使用锡箔纸以及自封袋包装样本,建议将样本液氮研磨后使用离心管/冻存管进行分装。

4.在使用PBS缓冲液/超纯水进行漂洗时,需要尽快处理。

5.植物各类组织样本建议都使用超纯水进行漂洗完之后,再研磨分装冻存,防止因种植过程中施加的一些肥料、农药等含有表面活性剂或其他杂质,对后续实验造成影响。


胞样本收集指南
 

悬浮细胞

1)连同培养基转移到1.5 mL的进口离心管中。

2)低速离心5 min(低于3000 rpm),使细胞沉淀于离心管的底部(1*107个细胞为宜)。

3)倒掉培养基(尽量倒干净),用预冷的PBS反复冲洗2 ~ 3次,低速离心5 min,弃上清。

4)标记离心管,将离心管的尖端插入液氮中,淬灭细胞沉淀1 min,-80 ℃冻存,干冰寄送。


贴壁细胞:

1)小心弃掉培养液,并将培养皿倒置于吸水纸上尽量吸干培养液;

2)加入4 ℃预冷的PBS平放轻轻摇动1分钟洗涤细胞(若用移液枪加,则靠着培养皿壁加入,以免将细胞冲起),然后弃PBS(建议用微量移液器少量多次吸尽残余PBS);

3)将培养皿底部(外壁)接触液氮,淬灭细胞(1*107个细胞为宜),加入500 μL预冷的甲醇-水4:1,V/V),用干净的细胞刮棒将细胞刮下,用移液枪转移至1.5 mL离心管

4)继续加入500 μL甲醇-水4:1,V/V),将剩余的细胞尽量全部转移至离心管中,使用封口膜将离心管密封,保存于-80 ℃,干冰寄送。


温馨提示:

1. 培养基倾倒时尽量倒干净,可使用滤纸将残留培养液吸净;

2. 甲醇/水请使用色谱纯及以上规格;

3. 液氮淬灭细胞时,请小心避免离心管破碎导致样本受损;

4. 建议细胞样本在进行培养时多准备样本,以备后续使用;

5. 贴壁细胞收集时如遇培养皿较大,1 mL试剂无法完全转移完全时,建议加入最大试剂体积不超过 3mL;

6. 若无试剂条件,也可在淬灭细胞后,不加入甲醇-水试剂,直接用干净的细胞刮棒将细胞刮下,转移至离心管;


其他类型样本收集指南


微生物样本

适用样本:大肠杆菌、枯草杆菌、酿酒酵母菌、恶臭假单胞菌、酵母、棒杆菌属、单胞藻、运动发酵单胞菌、氧化葡萄糖酸杆菌等。

1)连同培养基转移到进口的15 ml的离心管中,3000 rpm以下低速离心,使细菌沉淀于离心管的底部(1*108个细菌为宜);

2)倒掉培养基(尽量倒干净)后,用预冷的PBS溶液小心重悬清洗沉淀一次,4 ℃ 1000 g离心10 min收集菌体,弃上清;

4)将离心管的尖端插入液氮中,淬灭细菌1 min,然后-80 ℃冻存,干冰邮寄,每个样品最好准备两管以备用。


温馨提示:

(1)请先拿空离心管的尖端插入液氮中试试离心管的质量,避免因离心管破裂造成样本损失。

(2)操作尽量迅速,培养基尽量倒干净,可用滤纸条将管底部残留的培养基吸尽。

(3)微生物代谢速度非常快,所有的步骤需尽快完成。

(4)菌体数量不同的样本间需要保持一致。

(5)菌液的OD值仅供参考,需要根据具体情况确认菌浓度。


微生物培养液(检测胞外代谢):

方法一:

培养好的菌液混匀后,取10 mL菌液,用0.2 μm孔径的过滤膜进行快速抽滤,去除菌体。将滤液按1 mL/管进行分装,‐80 ℃冻存,干冰寄送。

方法二:

培养好的菌液混匀后,取1 mL菌液,3000 rpm,4 ℃离心10 min,取上清800 μL,‐80 ℃冻存,干冰寄送。


微生物—胞外代谢物(细胞上清)

1)使用合适的容器收集细胞培养液或其他生物液体;

2)3000g,4℃,离心15min,小心转移上清液至新的无菌离心管中;

3)将分离出的细胞上清液16000g,4℃,离心10min(枪头不要触碰到管底一侧的杂质)小心转移上清到新的无菌离心管中,-80℃保存。足量干冰寄送。

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温馨提示:

因培养基中可能含有高糖、高盐、高渗等成分,可能影响后续质谱上机检测,因此建议先进行售前咨询。
 

体液样本(如关节液、唾液、胆汁、脑脊液、瘤胃液等)

1)收集体液样本;

2)3000 rpm, 4 ℃ 离心15 min,取上清,0.5 mL/管分装至1.5 mL离心管中;

3)-80 ℃冰箱冻存。足量干冰寄送。


根际土壤样本

1)去除(抖落)根周松散的土:应尽量保证完整的根组织,并去除多余的土。

2)缓冲液震荡洗下根际土(紧密粘附):为防止在震荡过程中对微生物和根组织细胞的破坏,此处建议直接使用无菌水处理,震荡时有手动的,也有用摇床等震荡的,时间和强度根据洗涤的难易程度和根组织而异。

3)高速离心收集沉淀:用无菌水冲处理后之后,可高速离心后收集土壤沉淀,若沉淀较少,也可用提取水体DNA的方法,经0.22μm滤膜过滤收集土壤和微生物或者或者直接真空冻干处理(无冻干条件,可直接浊液冻存寄送,由实验室进行冻干,再取样做实验)。

4)保存:干冰寄送,低温-80℃保存。


根系分泌物样本

1)取整株植物的根部,迅速用1×PBS漂洗掉根上的泥土;

2)将整株根部至于装有超纯水的大容器中,培养一段时间;

3)取一定体积的根系分泌物液体样本, 1200rpm离心15min,去除杂质,用冷冻干燥仪冻成干粉;

4)-80度保存;足量干冰寄送。


温馨提示

1. PBS快速冲洗;

2. 根系分泌物所需体积因为培养植物根部分泌物质量不同,所以需要根据最终浓缩成干粉的量来定;

3. 因为粉末在寄送过程中容易分散到管壁,不好称重。建议在冻干前将EP管称重,冻干后将EP管和冻干粉一起称重后,记录清楚。


代谢组生物学重复建议

微生物和植物:建议每组生物学重复 ≥ 6 - 8个;

模式动物:建议每组生物学重复 ≥ 8 - 10个;

临床样本:建议每组生物学重复 ≥ 30个;


备注:

1. 在允许的条件下,多准备一份样本备用,且注意分装保存,避免反复冻融;

2. 样本数在10个以内的项目实验室默认不做QC,如有必要需备注;

3. 样本需干冰运输:快递途中干冰消耗率约为5KG/ 天,消耗速度与气温,泡沫箱厚度(>5cm)有直接关系,请酌情添加干冰


样本量需求:

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以上为常见样本的收集方法以及样本量需求,如果您的样本类型不包含在此说明内,欢迎给小鹿留言,我们有非常丰富的代谢样本收集和预处理的经验,可以与您分享;如果您收集的样本量没有达到以上要求,欢迎咨询我们的客户经理/技术支持,进行预实验测试,我们会以最低的样本量需求进行最严谨、可靠的实验!
 

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请持续关注我们,后期会继续分享代谢组实验设计、数据质控、代谢物定性筛选等代谢组学说明姊妹篇,不要错过哦!


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文章来源于鹿明生物

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