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茶香秘韵 | 山茶叶表皮蜡质GC-MS非靶向代谢组学“揭秘”茶之香气 

前言

 

福建省农业科学院茶叶研究所陈昌松教授课题组在Scientific Reports期刊发表的题为 “Tender leaf and fully-expanded leaf exhibited distinct cuticle structure and wax lipid composition in Camellia sinensis cv Fuyun 6”的研究成果,通过气相-火焰离子检测器(GC-FID)气相-色谱质谱联用技术(GC-MS),实现了对山茶叶表总蜡质的定性和定量分析,比较了山茶第二片叶和第五片叶表皮的蜡质结构和组成差异,初步分析了蜡质组成和发育阶段的关联。为揭开山茶叶不同发育阶段依赖性的代谢途径和调节机制提供了数据和方法基础。
 

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中文标题:山茶福云6号嫩叶和全开叶的表皮结构和蜡质组成比较

研究对象:山茶、叶表蜡质

发表期刊:Scientific Reports

影响因子:3.998

运用生物技术:气相色谱质谱联用(GC-MS)
 

研究背景
 

植物角质层几乎覆盖了所有陆生植物,在植物与环境的相互作用中起着多种作用。它减少非气孔性水分的损失,保护植物免受紫外线辐射,最大限度减少污染物滞留在叶表面,防御细菌和真菌的病原体,参与植物-昆虫的相互作用,调节花粉-雌蕊的相互作用,防止器官融合。这些不同的功能是通过表皮蜡的物理和化学性质来实现的,因此有大量的研究致力于描述不同植物物种表皮蜡的组成。这些研究确定,植物角质层蜡主要由长链脂肪酸及其衍生物,如醛、烷烃、支链烷烃、伯醇、仲醇、不饱和脂肪醇、酮、蜡酯,以及包括三萜和甾醇在内的环化合物组成。
 

茶是世界上最古老的不含酒精的含咖啡饮料,由山茶科茶树(Camellia sinensis L.)的嫩叶制成。采后凋萎是制作包括红茶、乌龙茶或白茶在内的几种茶的必要步骤。然而,角质层对茶叶加工效果的影响尚未引起足够的重视。近年来,从绿茶中鉴定出了一些较强的生物活性成分,如青茶醇(PC)。PC是一种长链(C20-C36)脂肪族伯醇的混合物,其在新鲜茶叶中的储存位置尚不清楚。长期以来,人们注意到红茶和乌龙茶的香气品质与叶角质层呈正相关,增加了香气前体可能储存在叶状蜡中的可能性。
 

研究策略
 

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研究方法
 

1.材料获取

福建农林大学茶园栽培的茶树福云6号。在快速生长的小枝达到一芽长6 ~ 7叶时采收,采集第2叶和第5叶进行代谢物分析。
 

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图1 | 来自生长树枝的不同叶片位置显示了山茶(福云6号)的不同细胞大小和结构特征

(a)树枝生长的叶片位置;

(b)同一枝从第一片叶子到第五片叶子的形态变化(bar = 1 cm);

(c–f)第一叶片(c),第二叶片(d)、第三叶片(e)和第五叶片(f)的横截面(bar = 50μm);

(g)不同叶片位置的表皮表皮细胞大小;

(h)在不同叶片位置的近轴叶片面积(n = 8)


研究结果
 

1、由透射电子显微镜确定的角质层厚度和超结构
 

为了观察嫩叶和完全膨胀叶之间的角质层的结构差异,采集了第二叶和第五叶,在透射电子显微镜(TEM)下观察了横截面,并测量了叶上表面和叶下表面的角质层厚度。在TEM下,叶表皮细胞层呈现白色外观。角质层本身形成了一个稍微电子密集的带,从而将角质层分成表皮蜡层和表皮内蜡层(图2a、d)角质层厚度测量表明,第二叶面平均总角质层厚度为1.15μm,表皮蜡层和表皮内蜡层平均总厚度为0.19μm和0.97μm;第二叶叶面的平均总角质层厚度为0.47μm,表皮蜡层和表皮内蜡层为0.13μm和0.34μm(图2a、b、e)。相比之下,第五叶的上表面和叶下表面的平均总角质层厚度增加了一倍,分别达到2.48 μm和1.05 μm。在第五叶的上表面上,表皮蜡层和表皮内蜡层分别为0.20μm和2.28μm;在下表面,表皮蜡层和表皮内蜡分别是0.18μm和0.87μm(图2e)。
 

这些观测表明,与同一叶的叶面上的角质层相比,轴面上的角质层厚了一倍以上,这种差异主要归因于叶表内蜡层。不同叶位的叶外蜡层的厚度只显示出细微的差别。相比之下,叶表皮内蜡层的厚度随着叶片的生长而显著增加(图2e)。作者还注意到,外表面的外表面显示相对直的轮廓,无论叶位置或叶面如何,这都是如此。然而,对于叶上表皮的叶表皮内蜡层,第二片保持相对平直。随着叶的生长,不再平直,取而代之的是许多沟壑状的突起(图2c、d)。这些结构改变在叶下表面不太明显(图2b、d)。
 

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图2 | 透射电镜观察山茶(福云6号)第二叶和第五叶的表皮结构(bar=2.0μm)

(a)第二片叶子的上表面;

(b)第二片叶子的下表面;

(c)第五片叶子的上表面;

(d)第五片叶子的下表面;

(e)叶片的表皮厚度

#2,第二个叶子位置;

#5,第五片叶子的位置 观察到细胞壁内部存在脂质包涵体

备注:表皮蜡(EWs)覆盖表皮固有层(C),该表皮嵌有角质层内蜡(IWs)。表皮层(CL)似乎也含有表皮内蜡。果胶层(pL),原生细胞壁(PWs)和质膜(PM)


2、嫩叶和完全膨胀叶的整体角质层定性组成
 

为了研究随着叶片生长可能产生的表皮成分变化,从整片叶子(叶上、下表面)中取样蜡,以通过气相色谱法(GC)-火焰电离检测器(FID)和质谱(MS)进行化学分析。初步筛选分别从第二片叶子和第五片叶子的蜡混合物中发现了40种和42种不同的化合物。在鉴定出的化合物中,通常从两片叶子中检出其中的31种。总共鉴定出51种不同的化合物。仅分别从第二片叶子和第五片叶子中检测到9种和11种化合物。另外,第二片叶子和第五片叶子中分别存在11种和16种未鉴定的化合物。根据化学结构,将51种鉴定出的化合物分为13种化学类别(图3)。
 

在许多物种的蜡中通常发现四类,包括游离脂肪酸,醛,正烷烃和1-烷醇。这些酯包括5种化合物,它们的酰基部分与各种脂族或芳族醇的组合不同。从两片叶子中都检测到了乙二醇。最后,仅在第五片叶子中发现的几种化合物被鉴定为萜类化合物。
 

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图3 | 从山茶(福云6号)的总叶蜡质混合物中鉴定出的化合物


3.第二片叶子和第五片叶子之间的蜡覆盖总量分析
 

虽然通常从两种叶蜡混合物中检测到61%(51个中的31个)化合物,但它们在这些成分的相对比例上显著不同。

从第二片叶子中提取的混合物以1-链烷醇为主(图3a-g和图4),占GC检测化合物的51.21%(2.437±0.235μg/cm2)(图4)。混合物中还包含着着大量的酸(1a-g)(16.57%;0.79±0.05μg/cm2)。

其他化合物占总叶蜡混合物的9.0-2.0%,包括:二醇(10a-10d)(8.87%;0.4220±0.007μg/cm2),烷烃(4a-f)(8.20%;0.390±0.037μg/cm2);苄基酯(7a-c)(2.89%;0.137±0.003μg/cm2),邻苯甲酸酯(9a,b)(2.43%;0.115.0070.007μg/cm2),烷烃(4a-f)(8.20%;0.390±0.037μg/cm2);(7-c)(2.89%;0.137±0.003μg/cm2),邻苯甲酸酯(9a,b)(2.43%;0.115.43%;0.115.115.43%;0.115±±0.007μg/cm2),乙二醇酯(6a)、单酰基甘油酯(6b,c)(2.76%;0.131±0.002μg/cm2)。(1.05%;0.050±0.007μg/cm2),苯乙酯(8a)(1.01%;0.0480±0.002μg/cm2),1-链烷醇酯(5a)(0.32%;0.32%;0.015±0.001μg/cm2),醛(3a,c)(0.21%;0.010±0.0004μg/cm2),苯乙酯8a(1.01%;0.0480±0.002±0.002μg/cm2),1-链烷醇酯(5a)(0.32%;0.32%;0.015±0.001μg/cm2),醛(3a、c)(0.21%;0.010±0.0004±0.0004·0.0004·g/cm2/cm2)和甾醇(13c)(0.15%,0.007±0.0004μg/cm2)也被检测到(图4)。

总之,第二片叶子的总蜡覆盖率为4.76μg/cm2,包括所有鉴定和未鉴定的化合物。所鉴定的化合物占GC检测到的蜡质量的96%。

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图4 | 山茶(福云6号)总蜡混合物的组成;覆盖第二叶和第五叶的蜡混合物中的化合物类别的覆盖率(μg/cm 2);条形代表平均值±标准误差(n=4)
 

与第二片叶子相比,第五叶的蜡混合物以三萜类化合物(12a-f)(33.06%;5.085±0.100μg/cm2)为主,其次是邻苯二甲酸酯(9a-d)(7.27%;1.119±0.081μg/cm2)(图4)。(4.36%;0.671±0.022μg/cm2),糖(10a-d)(3.76%;0.579±0.052μg/cm2),1-链烷醇2a-d,d,f(2.39%;0.368±0.010μg/cm2),酸(1a、b、d-f)(1.95%;0.301±0.026μg/cm2),糖10a-d(3.76%;0.579±0.052±0.052μg/cm2),1-链烷醇(2a-d、f)(2.39%;0.368±0.010μg/cm2),酸(1a、b、d-f)(1.95%;0.301±0.0.026±0.026μg/cm2),酸(1a、b、d-f)(μg/cm2)和烷烃(4a-f)(1.61%;0.247±0.007μg/cm2)分别占6.0%至1.0%。一些化合物以痕量存在,包括乙二醇酯(6a)、单酰基甘油酯(6b、c)(0.99%;0.152±0.012μg/cm 2),醛(3a-c)(0.80%;0.123±0.016μg/cm 2)和1-链烷醇酯(5a)(0.27%;0.041±0.006μg/cm 2)(图4)。

总的来说,第五叶的蜡覆盖率为15.38μg/cm2,GC检测到的蜡质量的42.91%是未鉴定的化合物。
 

4. 普通蜡类化合物的链长分布
 

游离脂肪酸、1-烷烃、醛和正构烷烃是常见的蜡成分,在茶叶和许多其他植物物种中都能找到。酸组分为偶数均质,碳链长度为C16 ~ C30(除C20外)。第2个叶片中C28的丰度最大,第2个叶片中C26的丰度最大(图5)。第5个叶片蜡除C22和C30外,其他的酸同源物都相同。C24只显示微量;C16、C18、C26和C28的分布几乎是均匀的(图5)。
 

伯醇(1-烷醇)馏分中除C20和C22外,其它均为偶数同系物,分布在C18 - C34之间。第2叶在C28和C30处表现出最大值(图5)。相比之下,C28和C32富集于第5叶;C30和C34缺失,其他的呈现相似的丰度(图5)。
 

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图5 | 山茶(福云6号)叶蜡中脂肪酸及其衍生物的链长分布;覆盖第二片叶子和第五片叶子的蜡质混合物中四种常见化合物类别各自的同系物的相对丰度(%)
 

山茶叶蜡由C26至C30范围内的偶数醛组成。第二片叶子由C30占据主导地位,其次是C26。从第二片叶子中未检测到C28(图5)。C30是第五片叶子中的主要醛,其次是C28的第二个最大值(图5)。蜡混合物中的烷烃馏分的特征是除C23和C33外,C21至C35为奇数同系物。C29是第二和第五片叶子中的主要成分,其他链长显示出相似的分布,除了第二片叶子中的C35是第二个最大值(图5)。
 

乙二醇组分为偶数编号的同系物,范围为C16至C22。C16在第二和第五叶片显示出最大的丰度,其他链长在两片叶片中均表现出相似的分布水平(图6)。

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图6 | 山茶(福云6号)叶蜡中乙二醇的链长分布;来自第二片叶子和第五片叶子的单个同源物的相对丰度(%)


5.蜡酯的链长分布
 

从第二片叶子中发现了五种化合物,其特征是在扩展的同系物系列中脂肪酸与各种醇之间的酯键,而从第五片叶子中仅检测到了三类(图7)。1-链烷醇酯是由乙酸酯与伯醇的酯化反应制得的,仅在第二和第五片叶子中检测到C20烷基链。在第二片叶子和第五片叶子中检测到乙二醇酯,其分布均匀,其特征是存在偶数编号的酰基链C16或C18和短链醇(C2)或甘油(C3),总碳数为18 ,19和21。
 

长链脂肪酸和芳族醇形成两类酯。苄基酯是通过将苄醇与C18,C20和C22脂肪酸酯化而形成的,因此总碳数分别为C25,C27和C29。苄酯显示出最大的C27丰度,随后第二个叶子中的C29达到第二个最大值。在第五片叶子中未检测到苄基酯。类似地,从第二片叶子中检测到苯乙酯,而从第五片叶子中检测不到,仅检测到C20酰基链长,苯乙酯的总碳数为28。

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图7 | 山茶(福云6号)叶蜡中酯类的链长分布;来自第二片叶子和第五片叶子的单个同源物的相对丰度(%)
 

邻苯二甲酸酯是通过邻苯二甲酸或对苯二甲酸与两种短链醇(C4或C8)的酯化反应形成的,总碳原子数为C16和C24。在第二和第五片叶子中,C24的丰度高于C16。总体而言,第五片叶子以邻苯二甲酸酯为主;相反,大多数酯类在第二片叶子中分布更均匀(图7)。
 

6.茶叶蜡的萜类成分
 

茶叶蜡中的萜类化合物,包括三萜和甾醇,主要从第五片叶子中检出,除了豆甾醇以外,从第二片叶子中检不到(图4和8)。三萜类化合物是第五片叶子中的主要成分(图4),包括α-淀粉蛋白,β-淀粉蛋白,羽扇豆酚,熊果酸,弗瑞德林和白桦蛋白。β-锚蛋白和白藜芦醇显示出最大的丰度,其次是弗瑞德林和熊果酸的第二丰度;α-amyrin和lupeol的含量较低(图8)。NMR31从茶提取物中鉴定出软木三萜酮,在这项研究中,作者还从茶叶蜡中鉴定出了软木三萜酮。
 

从第五叶蜡混合物中鉴定出四种甾醇,包括菜油甾醇,豆甾醇,羊毛甾醇和24-亚甲基环丁醇。菜油甾醇和羊毛甾醇显示出最大的丰度,其次是第二大的豆甾醇。从第五叶中也检测到痕量的24-亚甲基(图8)。从第二叶蜡混合物中仅检测到少量的豆甾醇(图4和8)。

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图8 | 茶树(福云6号)中萜类化合物在覆盖第二片叶子和第五片叶子的蜡混合物中的相对丰度


相关讨论
 

此前的研究发现,常规化学固定方法导致拟南芥茎角质层超微结构发生变化,推测可能是制备样品时使用的有机溶剂(丙酮或乙醇)去除了部分蜡。拟南芥茎的蜡主要是烷烃,烷烃更容易溶于等有机溶剂。相比之下,一些蜡的成分,如醛和三萜类化合物,在室温下仅微溶。一种比丙酮或乙醇强得多的蜡溶剂,预计一些蜡组分(醛或三萜类)在丙酮或乙醇中的溶解度很低。因此,角质层蜡的组成对其在特定有机溶剂中的溶解度有显著影响,将溶剂效应推广到所有植物品种是不合适的。Jetter和Riederer(2016)利用酶切分离了8种不同植物的表皮膜,然后通过SEM测量表皮厚度,发现表皮周周部分的平均厚度在1μm ~ 7μm之间。在这里,作者通过TEM图像测量角质层厚度,发现茶叶的正轴角质层厚度在1 ~ 2.5μm之间,因此作者的数据与该报道一致。
 

由于新叶在芽断后依次出现,作者首先探讨了叶片在生长枝条上的位置是否可以作为叶片发育阶段或发育状态的替代指标。在这项研究中,两条线的证据表明第二叶更有可能不成熟:

首先,从第二叶表皮细胞大小类似于第一个叶子,但叶面积比第一次更大的叶(图1 h),这表明第二叶仍然保持活跃的细胞分裂;

其次,第二片叶的结构特征,包括栅栏层的形成、叶肉细胞的形态、细胞的堆积模式和细胞间的空气空间,与第一片叶相比,第三片叶和第五片叶具有更高的相似性(图1c-f)。第二叶与第一叶相似,但第二片叶叶面积远大于第一叶,说明第二叶细胞分裂仍保持活跃状态;

其次,第二片叶的结构特征,包括栅栏层的形成、叶肉细胞的形态、细胞的堆积模式和细胞间的空气空间,与第一片叶相比,第三片叶和第五片叶具有更高的相似性。虽然叶片发育生物学已经很好地确定了叶片结构特征与其光合能力之间的相关性,但要将第二片叶片具体定义为“未成熟”,还需要对其碳状态有更直接的证据。当小枝长时间生长时,当前的第二叶被其他新生叶逐渐向下移动,最终完全展开,与其他完全展开的叶没有区别。
 

在制茶工业中,采收嫩枝(通常是一芽二叶)生产茶叶。因此,在较长一段时间内保持嫩枝是一个非常可取的农艺性状,也是新茶种育种的一个强烈目标,因为这可以延长收获时间而不影响收获季节的产品质量。
 

研究数据表明,从第2叶到第5叶叶表面积的增加归因于表皮细胞的扩张。因此,角质层也应相应地从第二片叶扩展到第五片叶。表皮细胞角质层如何扩大仍然是一个未解决的问题。当特定蜡的合成和运输组件不能跟上表皮细胞扩张,稀释效应也会发生,这将导致减少的报道这个特定的蜡质组分。第二片叶长链脂肪酸及其衍生物(包括酸、1-烷烃、醛和烷烃)的覆盖度为3.626μg/cm2;相比之下,长链脂肪酸及其衍生物在第五片叶的覆盖度为1.039μg/cm2。从表面上看,第5叶比第2叶的长链脂肪酸生物合成率更低。考虑到第5叶的总表面积是第2叶的3倍,说明第2叶和第5叶长链脂肪酸的总负荷相似。这些数据可能表明长链脂肪酸及其衍生物主要在嫩叶中形成,然后随着叶片的进一步生长发育,这些通路被显著抑制。这就合理地解释了为什么Choi et al. 所报道的绿茶是异丙酚的植物来源。作者的数据还表明,大量的仙人掌醇实际上是储存在嫩叶表皮蜡。通过酰基还原途径合成伯醇;相反,脱羰基化途径产生醛、烷烃、酮和仲醇。伯醇在第二叶的优势表明,这两种途径在嫩叶蜡脂生物合成的调控上存在差异。
 

三萜类化合物和类固醇混合物的覆盖率随着叶片的膨胀和生长而显著增加。以乙酰辅酶a为前体,通过甲羟途径在细胞质中生物合成三萜和甾类化合物,两种途径共有相同的中间体(3S)-2,3-环氧-2,3-二氢角鲨烯。长链脂肪酸由C16和C18脂肪酸合成,形成长度从C24到C36的长链脂肪酸。长链脂肪酸的合成是通过脂肪酸延伸酶在细胞质中进行的,并利用细胞质中的乙酰辅酶a作为脂肪酸延伸的前体。因此,超长链脂肪酸、三萜和类固醇的生物合成在代谢水平上是相互关联的;这些途径从细胞质中争夺相同的前体乙酰辅酶a。从这些数据作者可以推断,在嫩叶中,VLCFA通路非常活跃,而MVA通路不被激活;随着叶片的扩张和成熟,MVA通路被激活,而VLCFA通路被关闭,因此更多的胞质乙酰辅酶a被输入MVA通路,用于三萜和类固醇的生物合成。
 

长期以来,人们一直认为成品茶的香气质量与角质层蜡质含量呈正相关,本研究中对茶叶角质层蜡质的综合分析提供了新的见解。采摘嫩叶(通常为1芽2叶)泡茶时,作者发现第二片叶的表皮蜡富含脂肪酸及其衍生物,这些脂肪酸及其衍生物在红茶制作过程中可进一步氧化产生香气挥发物,包括茉莉酸甲酯、顺式茉莉酮、己醛、3-己烯醛、3-己烯-1-ol。与第五片叶子相比,第二片叶子的表皮蜡也富含酯类,包括苄酯、苯乙酯和邻苯二甲酸酯。这些酯都含有在酶的作用下释放的芳香前体。在红茶制作过程中,细胞壁在揉捻步骤中被分解,脂肪酶和其他酶从细胞中释放出来,然后在随后的发酵步骤中与香气前体反应,从而释放出香气化合物。


研究结论
 

综上所述,本文从山茶(福云6号)的两叶位置对角质层进行了全面的结构和组成分析,揭示了茶叶成熟过程中与蜡质生物合成的差别代谢规则。这为茶树相关基因的蜡生物合成功能表征提供了框架工作。


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这项研究旨运用GC-MS非靶向蜡质代谢组学在比较山茶的嫩叶和完全膨大的叶子之间表皮蜡质的结构和组成差异,进一步表征茶叶表面的蜡质生物合成代谢基础。此研究使用第二叶和第五叶分别代表了两个不同的发展阶段,对其角质层厚度、结构、叶蜡成分组成进行研究,分离出第二叶和第五叶总蜡脂质。气相色谱-质谱分析确定了属于13个化学类别的51种蜡质成分,包括酯、乙二醇、萜类、脂肪酸及其衍生物等。这些分析结果的证明了茶树叶片的蜡质特征与发育阶段有关,表明了不同的发育依赖性代谢途径和调节机制。


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参考文献:

1 Sieber, P. et al. Transgenic Arabidopsis plants expressing a fungal cutinase show alterations in the structure and properties of the cuticle and postgenital organ fusions. Plant Cell 12, 721–738 (2000).

2 Long, L. et al. The maize epicuticular wax layer provides UV protection. Functional Plant Biol. 30, 75–81 (2003).

3 Kerstiens, G. Signalling across the divide: a wider perspective of cuticular structure-function relationships. Trends Plant Sci. 1, 125–129 (1996).

4 Barthlott, W. & Neinhaus, C. Purity of the sacred lotus, or escape from contamination in biological surfaces. Planta 202, 1–8 (1997).

5 Jenks, M. A. et al. Chemically induced cuticle mutation affecting epidermal conductance to water vapor and disease susceptibility in Sorghum bicolor (L.) Moench. Plant Physiol. 105, 1239–1245 (1994).

6 Eigenbrode, S. D. & Espelie, K. E. Effects of plant epicuticular lipids on insect herbivores. Annu Rev of Entom. 40, 171–194 (1995).


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文章来源于鹿明生物

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