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Nat Comm|脂质组学如何选择灵敏度..4D蛋白组学可同时满足4大需求

脂类(lipid)分子由于其组成的多样性,结构上存在较多的同分异构体等现象,使针对脂类进行的组学研究(脂质组学)具有极大的挑战性。而当脂质组学遇到临床样品,例如血浆,活检组织时,样品的稀少又对检测手段的灵敏度提出了更高的要求。

 

传统上针对质谱组学的检测,一般使用基于超高分辨质谱的直接进样分析,或经过微升级流速的液相色谱-质谱联用进行分析,但受限于质谱扫描速度或分辨率等原因,这些手段都无法同时达到高通量,高灵敏度,高覆盖度和高重复性,制约了脂质组学的进一步应用。
 

近日,德国马普研究所Matthias Mann课题组Nature Communications上发表了基于PASEF技术的脂质组学完整分析流程,展示了该技术能同时满足高灵敏度、高覆盖率、高重复性和高通量的强大能力(1)。
 

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在该论文中,Mann课题组将其在蛋白质组学研究中提出的平行累积连续碎裂技术(parallel accumulation–serial fragmentation, PASEF)引入到脂质组学研究中。PASEF技术是搭载在布鲁克公司timsTOF Pro质谱上的数据采集方法,该方法利用了在传统的四级杆(用于母离子选择)之前引入了捕集离子淌度(trapped ion mobility, tims)技术,使其在选择母离子的时候,不仅仅依赖于质量(mass),还增加了碰撞横截面(collisional cross Sections, CCS)作为选择依据;由于离子淌度的扫描速度远远大于色谱峰宽,因此可以充分对一个色谱洗脱峰中的大部分离子进行分析。
 

如图1所示,相同的扫描周期内,传统的数据采集方法(TIMS-MS/MS)只能对1个母离子进行隔离碎裂,而基于PASEF技术的采集方法(TIMS-PASEF),则能对16个母离子进行隔离分析,大大提高了母离子的覆盖度。而进一步针对信号较弱离子的连续累积,则可以极大的提高碎片离子的图谱质量,提高检测的深度。


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图1 | TIMS-MSMS与TIMS-PASEF在相同扫描周期内选择母离子数量
 

为了展示该研究流程的特性(图2),Mann课题组对不同类型的样品(人类血浆,大鼠肝脏和Hela细胞)进行了脂类提取。值得注意的,为了展示灵敏度,其血浆样品的起始体积仅仅为1微升,充分考虑到了临床检测经常遇到的情况。提取后的脂类,通过纳升液相-质谱进行分析,单针样品的检测时间为30分钟,每个样品均进行正、负离子模式检测,使单个样品的检测周期为1小时。数据分析中引入碰撞截面积作为额外的提取指标,在分子特征提取过程中,除了常规的质荷比(m/z)、保留时间(retention time, RT)、丰度(intensity)外,增加了碰撞截面积(CCS),使传统的三维提取变成了四维提取,随后则通过MS2图谱的匹配来识别脂类分子,同样,在匹配过程中,四维数据均作为最后结果筛选的依据(图2)。
 

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图2 | TIMS-PASEF完整工作流程
 

在定性结果上,通过图3可以看出,在母离子覆盖率(指母离子被选择进行碎裂的比例)上,TIMS-PASEF带来了近10倍的提高(从TIMS-MS/MS的5.5%提高到了TIMS-PASEF的65%);随之带来的则是定性结果的进一步提高,基于TIMS-PASEF的数据,单针血浆样品(进样量0.05微升)可以检测到1108个特征性脂类(unique lipid,指去除所有加合峰之后的脂类)。
 

为了进一步验证该方法的高覆盖率,该课题组选用了由美国NIST提供的标准品(SRM 1950)进行检测,并与同样基于该标准品的已发表文献进行比较(图4),可以看出,针对常见的5大类脂类,除鞘磷脂(Sphingolipids)外,TIMS-PASEF技术的鉴定覆盖率均至少提高2倍,在甘油糖脂(Glycerolipids)上甚至带来了近4倍的提升。值得注意的是,TIMS-PASEF技术的高覆盖率,是建立在极低的样品进样量上,但仍然能保持较高的动态范围(约5个数量级),这点对于动态范围大并且样品珍贵的临床样品来说及其重要。
 

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图3 | TIMS-MSMS与TIMS-PASEF对不同样品的母离子覆盖率与脂类鉴定数目
 

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图4 | TIMS-PASEF结果与已发表文献的比较
 

除去鉴定覆盖率的提高,CCS值的引入对于脂类的定性分析还有更加引人入胜的前景。在图5所展示的离子洗脱模型中,可以看出在反相色谱分离维度上,大部分的脂类均根据其亲水性的不同,分布在不同的洗脱区间内;但是由于同分异构体的存在,传统上仅仅依靠洗脱时间和质量无法对同分异构体或质量非常接近的不同脂类进行区分。
 

CCS值的引入则为解决该问题带来的转机,部分同分异构体由于其CCS值存在差别,可以在CCS值的维度上分离,如图5c所示的TG 60:0, TG 60:1, TG 60:3和TG 60:4。此外,当仅仅靠MS2碎片无法充分的对离子进行识别时,CCS值的引入可以帮助其定性,同样在图5c中,TG 48:1由于MS2图谱质量不高,无法获得较好的鉴定,而此时通过其CCS值的数值,则可以帮助推测其结构为TG 48:1。

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图5 | TIMS-PASEF的反相色谱洗脱模型
 

对于脂质组学研究而言,除去定性分析,定量分析也十分重要。TIMS-PASEF方法是基于超高扫描速度的飞行时间质谱(TOF),其单个循环(包括1次母离子和3次子离子扫描)的扫描周期平均在0.4秒,在该速度下,可以保证即使在色谱峰宽最窄的纳升液相分离中,对单个色谱洗脱峰(平均峰宽6秒)仍然可以获得10个以上扫描点,而却确保了定量的稳定性和准确性。如图6(略)所示,在5次技术重复中,大部分的脂类样品在均可以在所有技术重复中被定量到,大部分的定量CV均小于15%。
 

最后作者指出,TIMS-PASEF技术可以应用于高灵敏度和高准确性的脂质组学,尤其该技术在建立综合性脂类数据库上,具有极为重要的应用价值。

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1.PASEF技术最早由Mann课题组应用于蛋白质组学领域,获得了极大的成功,尤其是其高灵敏度,对单细胞蛋白质组学研究有极大的推动。如今,Mann课题组又将PASEF的概念引入到脂质组学领域,与蛋白质组学类似,脂类组学也面临着灵敏度和样品高动态范围的挑战,因此PASEF技术在脂质组学研究领域有着良好的应用前景。

2.与蛋白质组学不同的是,脂质组学还存在着同分异构体的现象,CCS的引入可以为区分同分异构体,或者是区分质量重叠较为严重的质谱峰提供新的思路。

3.传统脂质组学研究,为了提高重复性,倾向于选择微升流速的色谱分离,从而无法兼顾灵敏度,进而影响到鉴定覆盖率,而TIMS-PASEF技术由于高扫描速度和扫描周期,可以在高灵敏度,高准确性的基础上保证重复性,从而为脂质组学研究带来的更好的体验。

4.在该文章中,也提供了CCS值的重复性和稳定性数据,在补充材料中,还提供了不同色谱分离时间的鉴定结果比较,显示了30分钟的色谱分离可以充分提高鉴定覆盖率,从而保证了该方法的高通量

5.剧透一下,鹿明生物已经引入了刚刚荣获HUPO技术突破大奖的布鲁克公司的timsTOF Pro质谱,为蛋白质组学和脂质组学客户提供更多的选择方案,欢迎各位老师来咨询哦~


鹿明生物4D-DIA蛋白质组学
 

鹿明生物一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。

日前,建立了自己的timsTOF Pro实验平台并引入与其超高MSMS扫描速度完美匹配的Evosep One高通量色谱,及其配套的Spectronaut软件

timsTOF Pro以其更灵敏、定量更准确、可鉴定出更多蛋白质的特点,运用在4D-DIA、4D-LFQ、4D-PRM的研究中。毋庸置疑新一代的4D蛋白组学时代已经来临。我们将携手各位老师一起进入更深入的蛋白组学。


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文章来源于鹿明生物

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