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项目文章|iTRAQ定量蛋白质组学助力南京农大茶树抗寒机制研究

前言

 

欧易/鹿明生物合作客户南京农业大学课题组BMC Plant Biology期刊发表的题为 “Physiological and iTRAQ-based proteomic analyses reveal the function of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) in improving tea plant (Camellia sinensis L.) tolerance at cold temperature”的研究成果,iTRAQ标记定量蛋白组学分析可以解释GABA诱导的茶树抗寒生理效应。功能蛋白-蛋白质网络分析进一步表明,内源GABA和胁迫响应物质的变化诱导了茶树光合作用、氨基酸合成和碳氮代谢之间的相互作用,相应的差异有助于茶树抗寒性的提高。

 

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中文标题:生理和iTRAQ蛋白质组分析揭示了外源γ-氨基(GABA)在提高茶树耐低温能力中的作用

研究对象:茶树

发表期刊:BMC Plant Biology

影响因子:3.497

合作单位:南京农业大学

运用欧易/鹿明生物技术:iTRAQ标记定量蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)

 

研究背景

 

茶叶是世界上的非酒精饮料之一,茶树是中国、印度、斯里兰卡和肯尼亚等许多国家最重要的商业作物之一。冷胁迫很容易干扰光合作用过程,光合作用过程是植物生产所需的最重要的过程,当茶树经历低温条件时,各种机制被调用,包括抗氧化能力、渗透调节、光合速率降低和GABA积累。这些过程涉及冷反应基因的表达,其中许多是由GABA调控。然而,对于处于最适温度和低温下的茶树来说,GABA调节哪些蛋白质在很大程度上是未知的。在本研究中,作者通过对茶树在适宜温度和低温下的生理学和iTRAQ蛋白质组分析,探讨了GABA的耐受机制。

 

研究策略

 

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研究结果

 

1、不同温度对茶叶内源GABA和谷氨酸含量的影响

 

低温处理第7天,茶叶内源GABA含量显著下降,第4天则无明显变化。然而,谷氨酸含量并没有表现出明显的变化(图1)。在最适温度下,GABA和谷氨酸的含量表现出几乎相同的趋势,均在0-4d内逐渐增加(图1)。在两种不同的温度下,茶树内源GABA含量随外源GABA的施用而显著变化,但只有在第7天的最适温度下,内源谷氨酸含量才显著变化(图1)。

 

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图1 | T1-T4处理期间内源GABA和谷氨酸含量的变化

T1:25℃、T2:25℃+GABA、T3:4℃、T4:4℃+GABA,数据表示平均值±标准差。

 

2、叶绿素荧光瞬变和JIP试验的SPAD值及耐性分析
 

在不施用外源GABA的情况下,较低温度下SPAD值显著低于最佳温度。然而,外源GABA在整个实验过程中提高了SPAD值(图2)。在无外源GABA的情况下,叶片在最适温度下的荧光瞬变曲线在0-7天呈现典型的OJIP形状。与最佳温度相比,冷处理的OJIP曲线的J阶跃生长速度要慢得多。相反,与不添加GABA相比,无论温度如何,外源GABA导致OJIP曲线的J阶跃水平显著增加。这种敏感性进一步证实了外源GABA提高茶树的耐寒性(图2)。

 

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图2 | 在T1-T4处理期间通过叶绿素荧光瞬变和JIP试验分析SPAD值的变化和耐受水平

 

3.温度及外源GABA处理对叶片蛋白质组学的影响
 

运用iTRAQ标记定量蛋白质组学,根据标准(FDR≤0.05,肽数≥2),从T1-T4组鉴定出1469个蛋白。根据差异蛋白(DAPs)筛选标准(FC > 1.5, p < 0.05),在T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3比较组中分别鉴定出186、165、193、125和224个DAPs。

 

层次聚类分析结果显示T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3的DAPs具有不同的表达模式(图3A)。T3/T1和T4/T3共有97个DAP,T2/T1和T4/T3共有54个DAP,T3/T1和T4/T1共有82个DAP(图3B)。其中有28、17、25、14和50个DAPs分别在T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3中独立表达(图3B)。

 

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图3 | 聚类分析

(A)聚类分析中的DAPs和(B)暴露于T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3处理7天后的茶树叶片数。

 

4. DAPs对外源GABA反应的GO和COG分析
 

通过GO分析,从细胞组成、生物学功能和分子功能等方面对T2/T1、T4/T1和T4/T3进行了蛋白质注释。根据分子功能将T2/T1、T4/T1和T4/T3的DAPs分为9类。并分别对3个比较组中的主要功能类别及DAPs的在茶树叶片中的主要细胞定位作了比较详细的展示(图4)。
 

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图4 | DAPs对外源GABA反应的GO和COG分析

T2/T1组中DAPs主要功能分类(A)和在茶树叶片中的细胞定位分布(B);

T4/T1组中DAPs主要功能分类(C)和在茶树叶片中的细胞定位分布(D);

T4/T3组中DAPs主要功能分类(E)和在茶树叶片中的细胞定位分布(F);
 

接着作者为了探讨外源GABA和温度对蛋白质氨基酸转运的影响,观察了氨基酸转运相关蛋白在T2/T1、T3/T1、T4/T3、T4/T1和T4/T2反应中的表达模式。有36种蛋白质被鉴定与氨基酸转运有关(图5),其中一些在应激反应物质的产生和代谢途径中有重要作用。
 

结果表明,在适宜温度和低温条件下,外源GABA处理的茶树氨基酸转运具有不同的表达模式。T3/T1和T4/T1相比,富含甘氨酸的RNA结合蛋白2(Q9SVM8)、3-磷酸莽草酸1-羧基转移酶(P05466)、烯醇化酶1(Q9C9C4)和果糖二磷酸醛缩酶3(Q9ZU52)的表达模式相同;醛缩酶超家族蛋白(F4IC59)、亮氨酸氨基肽酶2(Q944P7)的表达模式相同。T4/T1处理与T3/T1处理间无明显差异,T4/T1处理与T3/T1处理间多数氨基酸转运蛋白呈相反趋势。这些结果表明,外源GABA在低温胁迫下可使茶树体内的氨基酸转运向缓解低温胁迫的应激反应物质方向转移。所有氨基酸转运蛋白在T3/T1和T4/T3处理间均呈现相反的表达模式,说明在蛋白质水平上,有无外源GABA对低温胁迫有不同的缓解机制。

结合先前的研究表明,外源GABA可能导致氨基酸转运参与代谢途径以适应低温胁迫。

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图5 | T2/T1、T3/T1、T4/T1、T4/T2和T4/T3处理7d后茶叶氨基酸转运代谢中DAPs的聚类分析


5.外源GABA低温响应的相互作用网络分析
 

接着作者对T4/T3处理组中差异蛋白进行了PPI蛋白互作网络分析,其中涵盖了47中蛋白质(图6)。这些蛋白质在功能上可分为光合生物体的碳固定(13种蛋白质)、酸盐和二元酸盐代谢、氨基酸生物合成(17)、磷酸戊糖途径(8)、黄酮生物合成(4)、谷胱甘肽代谢(6)、TCA循环(5)、抗坏血酸和醛酸代谢(4)和嘌呤代谢等。这些可能是茶树在有外源GABA和无外源GABA时对低温反应的关键点。

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图6 | T4/T3处理组茶叶中DAPs的相互作用网络

说明:点代表蛋白质,红色代表表达增加,绿色代表表达减少。圆形矩形代表生物过程、细胞定位、分子功能或信号传导途径;蓝色代表显著较高,黄色代表较低的显著性。线表示彼此之间的关系;实线表示与相关验证的关系,虚线表示未验证

研究结论
 

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图7 | 外源GABA低温下对代谢途径中生理指标和DAPs的影响

 

(1)GABA有效地提高了茶树耐低温性,并在较高的SPAD值、叶绿素荧光瞬变和膜稳定性、抗氧化活性调节等方面反映了最佳条件下的各种生理生化过程;

(2)基于iTRAQ的蛋白质谱分析为揭示植物耐受性的代谢过程提供了一条全方面的道路,植物的低温耐受性是由内源性GABA调控的;

(3) 内源性GABA的转化不仅在功能蛋白网络中得到了进一步的证实,而且在代谢途径中也得到了揭示,如类黄酮代谢、氨基酸代谢、AsA/谷胱甘肽循环、TCA循环、酸循环、光合生物体的碳固定等;

 

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茶树体内γ-氨基(GABA)与逆境反应物质相互作用,可能参与在适宜温度和低温胁迫下差异丰度蛋白(DAPs)的调节。本研究中,将添加或不添加5.0 mMγ-氨基的茶树置于适宜温度或低温下生长。外源GABA引起的GABA水平的升高改变了谷氨酸、多胺和花青素等应激反应物质的水平,从而提高了抗寒性。基于iTRAQ技术发现DAPs参与了蛋白质代谢、核苷酸代谢、能量和氨基酸的转运代谢等生物过程、无机离子的转运和代谢、脂质代谢、碳水化合物的转运的代谢、次级代谢物的合成、抗氧化和应激反应过程。
 

iTRAQ分析可以解释GABA诱导的茶树抗寒生理效应。功能蛋白-蛋白质网络分析进一步表明,内源GABA和胁迫响应物质的变化诱导了茶树光合作用、氨基酸合成和碳氮代谢之间的相互作用,相应的差异有助于茶树抗寒性的提高。

 

文末看点

上海鹿明生物科技有限公司,一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀,公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台,并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。
 

参考文献:

Zhu X , Liao J , Xia X , et al. Physiological and iTRAQ-based proteomic analyses reveal the function of exogenous γ-aminobutyric acid (GABA) in improving tea plant (Camellia sinensis L.) tolerance at cold temperature[J]. BMC Plant Biology, 2019, 19(1).

 

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END

文章来源于鹿明生物

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