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两篇连发~转录组学+蛋白质组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究

前言

 

2020 年 8 月,华东师范大学赵云龙教授为通讯作者,在 Journal of Hazardous Materials (IF:9.038) 发表了利用转录组测序(由欧易生物提供技术支持)技术评估了纳米塑料对于水蚤毒理的分子机制文章之后。

2021年欧易/鹿明生物合作客户华东师范大学赵云龙教授课题组又在Science of the Total Environment发表的题为 “Development of an adverse outcome pathway for nanoplastic toxicity in Daphnia pulex using proteomics ”的研究成果,通过表型分析TMT标记定量蛋白质组学技术,发现了纳米塑料会对蚤状溞生长和繁殖产生不利影响,提出了纳米塑料毒性的有害结局路径。为进一步了解甲壳类动物以及其他水生生物中的纳米塑料毒性的机理奠定了基础。
 

两篇连发~转录组学+蛋白质组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究

 


中文标题:蛋白质组学揭示蚤状溞中纳米塑料毒性的有害结局路径

研究对象:蚤状溞,纳米塑料

发表期刊:Science of the Total Environment

影响因子:6.551

发表时间:2021年

合作单位:华东师范大学

运用欧易/鹿明生物技术:TMT标记定量蛋白质组学(由鹿明生物提供技术支持)


研究背景

 

过去几十年中,由于塑料产品的大量生产和使用,塑料废物被排放到陆地、淡水和海洋中。一旦进入环境,塑料垃圾可以通过物理、化学和生物因素降解为微塑料(小于5毫米)和纳米塑料(小于1微米)。这些塑料颗粒在环境中广泛分布,甚至在远离人类生活区的深海和极地环境中也发现了纳米塑料。水生生物可以通过饮食和水暴露于纳米塑料中,摄入纳米塑料可能会对生长、繁殖、氧化应激和免疫功能产生负面影响。然而人们对于纳米塑料在生态相关生物中毒性机理知之甚少。

 

研究思路

 

两篇连发~转录组学+蛋白质组学对水生生物中纳米塑料毒性机理研究

 

图1 | 实验设计和TMT标记定量蛋白质组学实验流程

 

研究结果
 

1、纳米塑料对蚤状溞繁殖和种群增长的影响

 

蚤状溞(Daphnia pulex)暴露于4种浓度(0.1, 0.5, 1和2 mg/L)的纳米塑料(nanoplastic)后,发现暴露于0.5、1和2 mg/L纳米塑料组的蚤状溞繁殖呈下降趋势(图2A),计算内禀增长率(intrinsic rate of increase)表明尽管在低浓度(0.1、0.5和1mg / L;p> 0.05)中未观察到差异,但在高浓度(2 mg/L)暴露后的蚤状溞的r值显著下降(图2B)。

 

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图2 | 纳米塑料对蚤状溞生殖(A)和内禀增长率(B)的影响

 

2、鉴定响应于纳米塑料的差异蛋白

 

TMT标记蛋白质组学质谱共鉴定到23,599种性的肽段和4,344种蛋白质,其中定量到了3,973种蛋白质(图3A)。超过73%的蛋白质至少鉴定到两个肽段(图3B),而98.5%的蛋白质分子量大于等于10 kDa(图3C)。此外49.6%的鉴定蛋白其序列覆盖度大于10%(图3D)。

 

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图3 | 鉴定和定量蛋白质

(A)TMT蛋白质组学中鉴定的谱图数、肽段数和蛋白数;(B)每个蛋白鉴定肽段数的分布;

(C)蛋白质分子量分布;

(D)蛋白质序列覆盖率的分布;

 

这些结果表明蛋白质组数据质量较好。纳米塑料处理组(1 mg/L)共鉴定出327种差异蛋白,其中76种上调,251种下调(图4A)。PCA的结果显示处理组三次重复聚集在一起,而对照组三次重复聚集在一起,说明处理前后两者差异较明显(图4B)。

 

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图4 | 差异蛋白火山图及PCA分析

(A)暴露于纳米塑料后蚤状溞的差异蛋白火山图;

(B)差异蛋白的PCA分析;

 

3.差异蛋白功能分析

 

差异蛋白GO富集分析结果显示排名前十的生物学过程涉及排毒(细胞排毒,细胞氧化剂排毒,对有毒物质的反应);代谢(细胞酰胺,活性氧和硫化合物代谢);组装(细胞外基质组装和基底膜组装);和发育(基于几丁质的角质层发育)(图5B)。KEGG通路富集分析发现两条发生显著变化的通路(图5C):ECM-受体相互作用(p = 0.00037)和谷胱甘肽代谢(p = 0.019)。

 

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图5 | 差异蛋白分析

(A)差异蛋白的聚类分析;

(B)差异蛋白的GO富集分析;

(C)差异蛋白的KEGG通路富集分析;

 

4. 蛋白质相互作用分析

 

差异蛋白的相互作用网络分析(图6)表明谷胱甘肽代谢在所有通路中占据主导地位。

 

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图6 | 差异蛋白的蛋白质相互作用网络


5.数据验证

 

为了进一步验证TMT标记定量蛋白质组学结果,作者对部分酶浓度和基因表达进行了定量。由于蚤状溞的繁殖也受到不利影响,因此也定量了VTG的表达。在高浓度纳米塑料中,T-GSH(总谷胱甘肽)、GSH(谷胱甘肽)、GSSG(氧化型谷胱甘肽)含量和GSH / GSSW显著增加(图7A-D)。基因表达变化分析表明,暴露于1 mg / L纳米塑料后,GSTs1b-2明显上调。暴露于0.1、1和2 mg/L后,GSTd/e11的表达增加;暴露于0.1 mg/L纳米塑料后,VTG的表达增加(图7E-G)。在所有测试浓度下被下调的基因是mTOR(图7H)。

 

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图7 | 暴露于纳米塑料后蚤状溞的酶浓度(mg/g protein)

(A)T-GSH(总谷胱甘肽);

(B)GSH(还原型谷胱甘肽);

(C)GSSW(氧化型谷胱甘肽);

(D)GSH / GSSW和相对基因表达;

(E)GSTs1b-2;

(F)GSTd/e11;

(G)VTG;

(H)mTOR;

 

相关讨论

 

本文通过TMT标记定量蛋白质组学发现纳米塑料处理蚤状溞后发生了涉及六个主要生理功能的蛋白质表达变化:氧化应激,信号转导,能量代谢,蛋白质和脂质代谢、角质层和几丁质酶通路(cuticle and chitinase pathways)。根据这些结果,作者提出了纳米塑料的有害结局路径(Adverse Outcome Pathway, AOP),其中包括ROS作为分子引发事件(MIE)。随后是特定信号通路的改变(Jak-STAT,mTOR和FoxO);引起谷胱甘肽代谢、蛋白质、脂质和蜕皮蛋白质(molting proteins)的变化;最终会抑制生长并降低生殖产量(图8)。

 

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图8 | 纳米塑料导致的有害结局路径示意图

 

研究结论

 

本研究对球形聚苯纳米塑料对蚤状溞的影响进行了系统的TMT标记定量蛋白质组学研究,并通过分子和生化测量进行了验证。获得的结果表明,与氧化应激、信号转导、能量产生、蛋白质和脂质代谢以及角质层和几丁质酶相对应的多种毒性通路均参与了纳米塑料介导的对蚤状溞繁殖力和生长的影响。这些通路被组装成一个有害结局路径,为进一步了解甲壳类动物以及其他水生生物中的纳米塑料毒性的机理奠定了基础。

 

小鹿推荐

 

当前对纳米塑料毒性机理了解甚少。本文作者评估了球形聚苯纳米塑料对蚤状溞繁殖的影响,并进行了蛋白质组学分析。结果表明暴露于纳米塑料后对蚤状溞的繁殖产生了负面影响。蛋白质组学共鉴定出327种差异表达蛋白,基于蛋白质组学数据分析和结果验证,作者提出了一种用于纳米塑料的有害结局路径。本文所用的是典型的蛋白质组学实验流程和数据分析思路,蛋白质组学技术为进一步了解纳米塑料毒性的机理提供了有力的技术支持。

 

鹿明生物

 

上海鹿明生物科技有限公司,一直专注于生命科学和生命技术领域,是国内早期开展以蛋白组和代谢组为基础的多层组学整合实验与分析的团队。经过近数年的发展沉淀,公司建立起了iTRAQ/TMT、DIA、PRM、修饰蛋白组等蛋白组学技术平台和全谱代谢组、靶向代谢组、拟靶向代谢组、脂质组等代谢组学技术平台以及相应的数据整合分析平台,并建立了科学完整的服务流程和精细规范的操作标准。

 

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END

文章来源于鹿明生物

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